[發明專利]一種鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 201911098145.9
• 申請日: 2019-11-12
• 公開（公告）號: CN110846289A
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 王成華;朱春燕;張婷;張冉
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 黃永校

一種鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶突變體及其應用，該突變體是將鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶進行如下任一突變后獲得的：(1)將鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶的ɑ亞基進行F296L突變；(2)將鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶的ɑ亞基進行Y351A突變；(3)將鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶的ɑ亞基進行S392A突變；(4)在鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶的ɑ亞基的E388與D389位之間插入一段長度由GHFCGLLQLSKRFEQ組成的15個氨基酸多肽片段。本發明的鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶突變體可利用空氣中氧氣作為電子受體，具有更好的底物親和力和催化效率，可降低生產成本，更加適用于工業化生產應用。

技術領域

本發明涉及一種鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶及其應用，在鮑氏不動桿菌黃嘌呤脫氫酶的基礎上，通過點突變制造黃嘌呤氧化酶活性增強的黃嘌呤脫氫酶突變體，及其在降解含次黃嘌呤和黃嘌呤材料中的應用，屬于生物技術領域。

背景技術

黃嘌呤氧化還原酶(Xanthine oxidoreductase，簡稱XOR)是一種包含鐵硫簇、鉬蝶呤和黃素輔基的氧化還原酶，它具有黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，簡稱XOD，EC1.17.3.2)和黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase，簡稱XDH,EC 1.17.1.4)兩種不同的存在形式。它可以利用O₂、NAD⁺和亞甲基藍等作為電子受體，氧化催化包括嘌呤、蝶呤、雜環分子等在內的多種底物的氧化反應(李麗書,陳獻華,邵葉波,等.黃嘌呤氧化還原酶的結構、功能和作用[J].細胞生物學雜志,2004,26(4):381-384.)。X0R具有重要的商業應用價值，其中黃嘌呤氧化酶的應用主要涉及五個方面，分別是藥物代謝、核苷類藥物合成、體外檢測、生物修復、健康食品方面(王成華,邢新會.黃嘌呤氧化酶的研究進展及其發展前景[J].廣西科學,2017,24(1):15-24.)。臨床上可用于制備免疫抗體、腫瘤抑制劑和細胞缺血性再灌注損傷等疾病的檢測(李忠琴.節桿菌黃嘌呤氧化酶的發酵、純化、特性及基因研究[D].江蘇:江南大學,2007.)。

XOD是由前體蛋白XDH經過巰基氧化可逆轉變或者通過酶解斷裂不可逆轉變而來，利用分子O₂作為電子受體，但失去了XDH所具有的利用NAD⁺作為電子受體的能力。它們是同一基因轉錄表達的產物，其中XDH是基因轉錄后的直接產物，是在體內的主要存在狀態(Woolfolk,C.A.and J.s.Downard,Distribution of xanthine oxidase and xanthinedehydrogenase specificity types among bacteria.J Bacteriol,1977.130(3):1175-91)。相對于XDH利用昂貴的NAD⁺作為電子受體而言，可以直接利用空氣中0₂作為電子受體的XOD成為商業用酶的首選。

目前，商品化X0D僅限于提取法生產。例如從牛奶奶油等動物源材料中提取的牛奶XOD，從野生藤黃節桿菌等野生微生物中提取的細菌XOD。牛奶黃嘌呤氧化酶是目前市場上最主要的XOD，也是最早獲得專利并投向市場的酶。然而，XDH到X0D的復雜轉變過程，存在著活性X0D與前體蛋白混雜與活性XOD含量低的問題，不僅影響到XOD的活性和得率，還增加了酶的使用成本，造成XOD價格高昂，限制了其應用發展(Enroth,C.,et al.,Crystalstructures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase:structure-based mechanism of conversion.Proc Natl Acad Sci USA，2000.97(20):10723-8)。