[發(fā)明專利]一種脂肪組織的單細(xì)胞懸液的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911094195.X
• 申請(qǐng)日: 2019-11-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111088222B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳東煌;陳海佳;葛嘯虎;姜交華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東國(guó)科細(xì)胞科技有限公司;廣東省康琪萊精準(zhǔn)醫(yī)療研究院
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 王小清

1.一種脂肪組織的單細(xì)胞懸液的制備方法，其特征在于，包括：

步驟1：取脂肪組織，以復(fù)合酶解液酶解；

步驟2：將所述酶解后的產(chǎn)物過(guò)濾，離心，取細(xì)胞沉淀清洗后加紅細(xì)胞裂解液裂解；

步驟3：將所述裂解后的產(chǎn)物離心，取細(xì)胞沉淀清洗、重懸，獲得單細(xì)胞懸液；

所述復(fù)合酶解液為中性蛋白酶、膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II、膠原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse；

其中，步驟1中，所述復(fù)合酶中，膠原蛋白酶I的工作濃度為1.0~2.0mg/mL；膠原蛋白酶II的工作濃度為0.5~1.0mg/mL；膠原蛋白酶IV的工作濃度為0.25~1.0mg/mL；中性蛋白酶的工作濃度為?0.25~0.5mg/mL；胰蛋白酶的工作濃度為0.25~0.5mg/mL；DNAse的工作濃度為0.01~0.02mg/mL，膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II、膠原蛋白酶Ⅳ、中性蛋白酶、胰蛋白酶和DNAse的質(zhì)量比為100:50:25:25:25:1；所述脂肪組織與復(fù)合酶解液的體積比為1:5~10；所述酶解的溫度為35-38℃，酶解的時(shí)間為20-40min；所述酶解用含血清的完全培養(yǎng)基終止；

步驟2中，所述過(guò)濾為70μm?細(xì)胞篩子過(guò)濾；所述離心為300g?~400g離心5min；所述清洗為取細(xì)胞沉淀以DMEM培養(yǎng)液重懸，使用密度梯度離心液3000g離心10-20min，去除細(xì)胞碎片及上清，再以PBS緩沖液重懸細(xì)胞，500g離心5min，棄上清；

步驟3中，所述離心為300g?~400g離心5min；所述清洗為取細(xì)胞沉淀以PBS緩沖液重懸，150-200g離心5-10min，去除殘余紅細(xì)胞裂解液及碎片，收集底部細(xì)胞；所述重懸以含0.5%BSA的PBS緩沖液重懸，重懸的次數(shù)為兩次，兩次重懸之間還包括以40μm細(xì)胞篩子過(guò)濾的步驟。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述復(fù)合酶解液的溶媒為基礎(chǔ)培養(yǎng)基或PBS緩沖液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述復(fù)合酶解液中，復(fù)合酶的濃度為0.5~5mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，在所述酶解前還包括對(duì)脂肪組織預(yù)處理的步驟，所述預(yù)處理為將脂肪組織用DMEM培養(yǎng)基漂洗三次，去除組織中血管及表面膜結(jié)構(gòu)，然后剪切成1-3mm³大小的組織塊。