[發(fā)明專利]全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的構(gòu)建方法、其調(diào)控方法及其轉(zhuǎn)錄因子的篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911085329.1
• 申請日: 2019-11-08
• 公開（公告）號: CN110699372B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段練;高文曦;朱丹丹;沈培;張?zhí)煊?/a>;段義農(nóng)
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 徐思波

本發(fā)明提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3?TREM?1的構(gòu)建方法，包括以下過程：收集小鼠肝臟組織，抽提小鼠肝臟組織的DNA，并以所抽取的DNA為模板及根據(jù)TREM?1啟動子特異性引物進(jìn)行PCR，獲得的PCR產(chǎn)物連接至PGL3?Basic載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得的陽性克隆進(jìn)行酶切、PCR及測序鑒定，對所構(gòu)建的PGL3?TREM?1進(jìn)行活性鑒定，PGL3?TREM?1構(gòu)建成功。本發(fā)明還提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3?TREM?1的調(diào)控方法，根據(jù)調(diào)控需求選擇以后抑制方法或增強(qiáng)方法；本發(fā)明的實施例另外還提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3?TREM?1的轉(zhuǎn)錄因子的篩選方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的構(gòu)建方法、其調(diào)控方法及其轉(zhuǎn)錄因子的篩選方法。

背景技術(shù)

巨噬細(xì)胞極化過程涉及多種細(xì)胞因子和受體，其中髓系細(xì)胞觸發(fā)受體（triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM）是近年來引起人們關(guān)注的一類分子。TREMs是一類隸屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面受體，主要包括TREM-1和TREM-2等，在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，TREM-1信號通路的激活能夠促進(jìn)單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-8等促炎因子，在炎癥反應(yīng)的觸發(fā)和放大過程中起著重要作用。同時，TREM-1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)都能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，也就是說TREM-1具有使巨噬細(xì)胞從M2型向M1型極化的能力。血吸蟲病肝纖維化發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞從M1逐漸向M2期轉(zhuǎn)化，研究表明，曼氏血吸蟲感染進(jìn)程中脾臟巨噬細(xì)胞TREM-1表達(dá)持續(xù)增加，感染后第5周達(dá)到高峰，其后逐步下降。TREM-1在血吸蟲病肝纖維化進(jìn)程中的表達(dá)變化機(jī)制，未見報道；血吸蟲病主要表現(xiàn)為以蟲卵為中心的炎性肉芽腫形成以及肝纖維化形成，研究表明血吸蟲肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展與血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）密切相關(guān)，SEA 作為一種混合蛋白，其組分蛋白尤其P40 蛋白對肝臟巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制的研究尤為重要，而其重組蛋白rSjP40對巨噬細(xì)胞中TREM-1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，也尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的構(gòu)建方法、其調(diào)控方法及其轉(zhuǎn)錄因子的篩選方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施例提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下過程：收集小鼠肝臟組織，抽提小鼠肝臟組織的DNA，并以所抽取的DNA為模板及根據(jù)序列號：ENSMUSG00000042265的序列所設(shè)計的TREM-1啟動子特異性引物進(jìn)行PCR，獲得的PCR產(chǎn)物連接至PGL3-Basic載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得的陽性克隆進(jìn)行酶切、PCR及測序鑒定，對所構(gòu)建的PGL3-TREM-1進(jìn)行活性鑒定，PGL3-TREM-1構(gòu)建成功。

進(jìn)一步的，所述全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的活性鑒定包括以下過程：將PGL3-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，熒光素酶活性檢測試劑盒檢測PGL3-TREM-1啟動子活性。

本發(fā)明的實施例另外提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的調(diào)控方法，其特征在于，根據(jù)調(diào)控需求選擇抑制方法或增強(qiáng)方法，具體包括，a. 抑制方法：將PGL3-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，并經(jīng)rSjP40處理，熒光素酶活性檢測試劑盒檢測PGL3-TREM-1啟動子活性，PGL3-TREM-1啟動子活性降低；b. 增強(qiáng)方法：將PGL3-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，經(jīng)作為作為陽參的LPS刺激后，熒光素酶活性檢測試劑盒檢測PGL3-TREM-1啟動子活性，PGL3-TREM-1啟動子活性增強(qiáng)。

本發(fā)明的實施例另外還提供全長啟動子質(zhì)粒PGL3-TREM-1的轉(zhuǎn)錄因子的篩選方法，其特征在于，包括以下過程：

（1）根據(jù)生物信息學(xué)分析顯示PGL3-TREM-1質(zhì)粒所包含的啟動子區(qū)域上，存在轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a結(jié)合位點；