[發(fā)明專利]基于共享性引物探針檢測(cè)基因多態(tài)性的試劑盒、方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201911055308.5
• 申請(qǐng)日: 2019-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN110628883B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 扶媛媛;周洋;蘇正穩(wěn);曹彥東;王利;郝俊;楊穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京安智因生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12Q1/686;C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 北京力量專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 樊穎

本申請(qǐng)公開了一種基于共享性引物探針檢測(cè)基因多態(tài)性的方法、試劑盒及其應(yīng)用。該方法將報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在同向性設(shè)計(jì)的野生型ARMS引物和突變型ARMS引物5′端，制備具有探針性的ARMS引物，并經(jīng)篩選后用于基因的多態(tài)性檢測(cè)，尤其針對(duì)人CYP2C19多態(tài)性檢測(cè)。本方法設(shè)計(jì)簡單，成本低廉，同時(shí)檢測(cè)靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，結(jié)果更準(zhǔn)確客觀。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基因多態(tài)性的PCR檢測(cè)。

技術(shù)背景

目前用于檢測(cè)基因多態(tài)性的方法主要有以下幾種：測(cè)序分型法、高分辨率熔解曲線分型法、基因芯片分型法、TaqMan探針分型法和MGB探針分型法等。測(cè)序分型法是該領(lǐng)域檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但受限于操作繁瑣性和設(shè)備特殊性，沒有廣泛推廣；而其余方法都是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)衍生而來，使用相對(duì)廣泛。其中，測(cè)序分型法檢測(cè)過程包含PCR擴(kuò)增、測(cè)序，操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間一般長達(dá)4～5個(gè)小時(shí)，而且操作過程中需要打開PCR反應(yīng)管，容易帶來PCR產(chǎn)物的污染；高分辨率熔解曲線分型法的特征是利用多態(tài)性位點(diǎn)的堿基不同而帶來的Tm值差別，通過識(shí)別不同的Tm值而進(jìn)行檢測(cè)，往往野生型和突變型位點(diǎn)的Tm值差別不到1℃，所以需要精準(zhǔn)識(shí)別溫度的設(shè)備，這類設(shè)備比較少，而且大多屬于進(jìn)口，價(jià)格昂貴；基因芯片分型法檢測(cè)過程包含PCR擴(kuò)增、探針雜交，操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間一般長達(dá)4～5個(gè)小時(shí)，而且操作過程中需要打開PCR反應(yīng)管，容易帶來PCR產(chǎn)物的污染；TaqMan探針分型法是利用ARMS引物識(shí)別多態(tài)性位點(diǎn)，該方法學(xué)檢測(cè)一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)需要2個(gè)反應(yīng)孔，通量相對(duì)較低；MGB探針分型利用MGB標(biāo)記的探針識(shí)別多態(tài)性位點(diǎn)，MGB探針設(shè)計(jì)難度大，價(jià)格高，且尋找一條合適的MGB探針需要篩選很多條，成本較高。

CYP2C19酶的編碼基因?yàn)镃YP2C19基因，位于人類10號(hào)染色體上，是細(xì)胞色素酶(CYP450酶)第二亞家族中的重要成員，是人體重要的藥物代謝酶，在肝臟中有很多表達(dá)。CYP2C19的基因多態(tài)性與藥物的個(gè)體差異密切相關(guān)，通過檢測(cè)患者CYP2C19基因型，可判斷患者代謝速率類型，合理調(diào)整用藥劑量，是提高相關(guān)疾病治愈率，減少毒副作用的有效途徑，尤其像氯吡格雷、伏立康唑、抗抑郁類藥物、抗癲癇藥物等。現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)人CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)手段主要是上述5種方法。

可見上述方法仍存在諸多缺陷，有必要尋求一種新的檢測(cè)方法，使檢測(cè)效果更特異、靈敏度更高、通量更高、結(jié)果更客觀等，同時(shí)還保證設(shè)計(jì)簡單、成本低廉、操作簡便、檢測(cè)時(shí)間短等。基于此，特提出本申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)的第一目的在于提供一種基因多態(tài)性檢測(cè)的共享性ARMS引物探針制備方法；

本申請(qǐng)的第二目的在于提供一種基于共享性引物探針檢測(cè)基因多態(tài)性的方法；

本申請(qǐng)的第三目的在于提供一種基于共享性引物探針檢測(cè)基因多態(tài)性引物體系、試劑盒及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用的技術(shù)方案如下：

本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N用于基因多態(tài)性檢測(cè)的探針性ARMS引物制備方法，所述方法包括針對(duì)野生型位點(diǎn)和突變型位點(diǎn)同向設(shè)計(jì)野生型ARMS引物和突變型ARMS引物，所述野生型ARMS引物和突變型ARMS引物5′端最后一個(gè)堿基通過不同報(bào)告基團(tuán)的標(biāo)記，引物和探針共享同一條核苷酸序列，制備具有探針性質(zhì)的探針性ARMS引物(見圖1-3)；

優(yōu)選的，所述報(bào)告基因選自FAM、ROX、TET、VIC、JOE、HEX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、Texas Red、LC RED640或LC RED705；

在一些實(shí)施方式中，進(jìn)一步包括篩選高擴(kuò)增效率引物作為制備探針性ARMS引物；

在一些實(shí)施方式中，進(jìn)一步包括淬滅探針和下游引物的設(shè)計(jì)；

在一些實(shí)施方式中，所述淬滅探針是針對(duì)野生型探針性ARMS引物和突變型探針性ARMS引物設(shè)計(jì)互補(bǔ)核苷酸序列，并對(duì)互補(bǔ)核苷酸序列的3′端進(jìn)行非熒光淬滅基團(tuán)的標(biāo)記；