[發明專利]能夠滿足谷子雜交種純度鑒定要求的單粒醇溶蛋白提取方法

有效

• 申請號: 201911044809.3
• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN110615834B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 劉丹;劉正理;李承宗;崔燕嬌;李強;王建賀;梁丹;李素英;曹婷婷;趙子龍
• 申請（專利權）人: 天津市農作物研究所（天津市水稻研究所）;唐山師范學院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/14;C07K1/30
• 代理公司: 石家莊輕拓知識產權代理事務所(普通合伙) 13128
• 代理人: 張培元

本發明公開了一種能夠滿足谷子雜交種純度鑒定要求的單粒醇溶蛋白提取方法，所采用的醇溶蛋白提取液具有如下組份：NN?二甲基甲酰胺10體積份，蔗糖20重量份，異丙醇50體積份，去離子水補充提取液到100體積份；并在醇溶蛋白的提取過程中，控制提取溫度為65℃。本發明的方法建立了一套適用于谷子單粒醇溶蛋白提取方法，為開展谷子雜交種的純度鑒定、品種管理以及大面積推廣研究提供了有力的技術支持。

技術領域

本發明涉及植物醇溶蛋白提取技術，具體涉及一種單粒谷子種子醇溶蛋白提取方法。

背景技術

20世紀90年代以前，谷子雜交種鑒定主要通過父母本苗色的差別，選用苗色深的常規材料做父本，以苗色較淺的不育系為母本，依據深顏色對淺顏色為顯性的遺傳規律，雜交種與父本顏色相同，通過拔除雜交種中混雜的顏色較淺的母本，去除雜株，也通過調查其中顏色較淺的不育株的比例確定雜交種的純度，這一方法雖然能去除雜交種中的部分雜株，但限制顏色較深的不育系的應用，且費工費時，不能去除雜交種中混雜的恢復系和其它材料，鑒定的純度也不準確。20世紀90年代以后，隨著抗除草劑材料的引進、創制成功，通過培育抗除草劑的恢復系，而不育系不抗除草劑，利用抗除草劑性狀顯性遺傳的特點，通過苗期噴施除草劑殺除其中假雜種，來鑒定雜交種的純度、去除假雜種，這一方法，使各種苗色的不育系均能獲得應用，但也不能鑒定出雜交種混雜的恢復系或其它抗除草劑材料，仍不能徹底去除雜交種中的假雜種，也不能準確的鑒定雜交種的純度。因此，創造一種能夠準確鑒定雜交種純度的方法成為對谷子雜交種進行品種管理、保證其增產效果的當務之急。

利用分子標記構建每個品種的指紋圖譜，是目前常用的作物雜交種乃至品種純度、甚至真假鑒定的常用方法，但是這種方法需要使用較多的典型引物，且要求引物多態性較好，否則，構建的品種的指紋圖譜不夠準確，也難以準確的鑒定雜交種的純度，同時該方法需要經過育苗、DNA提取、電泳、讀帶等過程，操作復雜，鑒定時間長，不適合大批量的進行雜交種純度鑒定。

醇溶蛋白是禾本科作物種子中的一種主要的貯藏蛋白，是種子萌發時C和N的主要來源^[1,2]。其電泳帶譜完全受基因型控制，不受環境條件影響，且遺傳變異豐富,在品種間存在著穩定的多態性，可作為品種的“指紋”^[3]。同時，其多態性檢測不需要育苗、DNA提取、聚合酶鏈式反應等環節，操作簡單，已在小麥、水稻等作物品種鑒定、純度分析、種質資源的鑒定評價、物種遺傳多樣性研究等方面廣泛應用^[4]；國際種子檢驗協會已把小麥醇溶蛋白帶譜鑒定作為標準方法用于小麥種子的純度鑒定^[5]，因此，醇溶蛋白在品種的真假和純度鑒定中的作用越來越受到科研人員的重視。

關于玉米、高粱、小麥、大麥、水稻的醇溶蛋白提取方法已有一些報道^{[6,7,8,9,10,11,12]}，與上述作物相比，谷子的醇溶蛋白分子量小、粒小，千粒重2.5g左右，僅為小麥、高粱、水稻的1/10-1/20左右，比玉米更小，提取難度更大，上述作物醇溶蛋白提取方法很難直接用于谷子醇溶蛋白的提取，更不能用于谷子單粒醇溶蛋白的提取，因此，欲開展利用谷子醇溶蛋白鑒定雜交種純度的技術體系，必須先開展單粒法谷子醇溶蛋白提取技術研究，首先要根據谷子醇溶蛋白的特點，探明適宜谷子醇溶蛋白提取的試劑及建立適宜谷子醇溶蛋白的提取體系、反應條件。而谷子醇溶蛋白的突出特點是分子量小、且仍存在較大差別，在14kDa--66kDa之間，要建立適宜單粒谷子的醇溶蛋白提取技術，首先要篩選、組配出能夠很好的溶解含有分子量不一的醇溶蛋白谷子粉末的有機溶劑；其次，要篩選、增加能凝聚蛋白的試劑，創造適宜它們發生反應的環境條件，徹底提取谷子籽粒中的醇溶蛋白。