[發明專利]能夠滿足谷子雜交種純度鑒定要求的單粒醇溶蛋白提取方法有效
| 申請號： | 201911044809.3 | 申請日： | 2019-10-30 |
| 公開（公告）號： | CN110615834B | 公開（公告）日： | 2022-07-29 |
| 發明（設計）人： | 劉丹;劉正理;李承宗;崔燕嬌;李強;王建賀;梁丹;李素英;曹婷婷;趙子龍 | 申請（專利權）人： | 天津市農作物研究所（天津市水稻研究所）;唐山師范學院 |
| 主分類號： | C07K14/415 | 分類號： | C07K14/415;C07K1/14;C07K1/30 |
| 代理公司： | 石家莊輕拓知識產權代理事務所(普通合伙) 13128 | 代理人： | 張培元 |
| 地址： | 300112*** | 國省代碼： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 能夠 滿足 谷子 雜交種 純度 鑒定 要求 單粒醇溶 蛋白 提取 方法 | ||
1.能夠滿足谷子雜交種純度鑒定要求的單粒醇溶蛋白處理方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：
A、谷子單粒醇溶蛋白的提取；
A-(1)樣品的準備：選取120粒飽滿的谷子雜交種種子及其母本、父本種子各8粒，每粒種子分別裝入1個內壁光滑的小紙袋中，做好標記；然后將種子砸成粉末狀，將粉末放置于2.0ml離心管中；
A-(2)配制谷子醇溶蛋白提取buffer，如下表1：
1.谷子醇溶蛋白提取buffer配方
A-(3)向每個裝有谷子粉末樣品的離心管中，加入谷子醇溶蛋白提取buffer 50μl，蓋好蓋子，渦旋震蕩混勻，放入65℃烘箱過夜；
A-(4)取出步驟A-(3)中的離心管，放入離心機，嚴格配平，12000rpm，離心10min；
A-(5)取新的1.5ml離心管，并在離心管中加入15μl A-PAGE loading buffer，配方如下表2：
2.A-PAGE loading buffer配方
A-(6)分別用移液槍取步驟A-(4)制得的上清液30ul加入步驟A-(5)制得的裝有A-PAGEloading buffer的離心管中，依次編號，確保順序編號一致；離心1min，渦旋震蕩混勻，然后用瞬時離心機調平離心1min，放入冰箱過夜，低溫促進醇溶蛋白析出與loading結合，即可提取到能夠滿足谷子雜交種純度鑒定要求的醇溶蛋白；
B、醇溶蛋白多態性檢測；
操作步驟包括：
B-(1)將電泳用的耳板和大板仔細清洗干凈；
B-(2)配制凝膠，配方見表3、表4，配置前將燒杯、量筒洗刷干凈，并配制好FeSO4工作液，即FeSO40.04g+1ml ddH2O；
3.1L凝膠buffer配方
4.凝膠配方：100ml，2板膠
B-(3)首先檢查步驟B-(1)清洗的玻璃板是否干凈，然后將玻璃板耳板與大阪拼合，耳板朝外，安裝到做膠架上，并用長尾夾固定到做膠架上，雙面安裝好后，放到封底架上，封底；
B-(4)檢查梳子是否干凈，確保梳齒上無膠粒，并用毛巾擦干，確保無雜物；
B-(5)配制H2O2工作液：將30％的H2O2儲存液劇烈晃動混勻，吸取出200μl加入三角瓶中，并加入2ml ddH2O，混勻；
B-(6)將步驟B-(2)中配置好的凝膠用玻璃棒再次攪動、混勻，檢查藥品是否充分溶解，混勻后分裝到2個干凈的100ml的燒杯中，記為燒杯A和燒杯B；
B-(7)用移液槍上下吸吹混勻步驟B-(5)配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到步驟燒杯A中，輕輕晃動混勻，迅速倒入安裝好的玻璃板中，倒滿后插入梳子；
B-(8)上下吸吹混勻步驟B-(5)配制的H2O2工作液，然后吸出150μl H2O2工作液，加入到燒杯B中，輕輕晃動混勻，迅速倒入安裝好的玻璃板中，倒滿后插入梳子；
B-(9)配制20X電極buffer，配方見表5，用量筒取50ml 20x電極buffer，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力攪拌器上混勻；
5.1L 20X電極buffer配方
B-(10)步驟B-(7)、B-(8)的膠體凝固后，拔下梳子，打開封底架，拆下長尾夾，耳板朝內，將玻璃板安裝到電泳儀上，四個角的螺絲均勻上緊，然后將安裝好的電泳儀放置到電泳槽內；
B-(11)關掉步驟B-(9)的磁力攪拌器，并用將該步驟配制的1X電極buffer倒入步驟B-(10)準備的電泳儀上的槽中，檢查是否漏液，確保不漏液后，再在下槽中加入步驟B-(9)制備的1X電極buffer，確保介于最低和最高線之間；
B-(12)將電泳儀與冷凝管連接，打開長尾夾，開啟冷凝系統，在確保電泳儀為“run”的狀態下，設定溫度24℃；
B-(13)檢查步驟B-(12)各種設定準確無誤后，從左到右依次上樣10μl，各板的順序均為15個雜交種、2個母本、2個父本、15個雜交種，加樣后，接上電極；在500v電壓下，電泳1h30min；
B-(14)完成電泳后，關掉電泳儀電源，關掉冷凝系統，用長尾夾夾住冷凝管，關閉冷凝系統進出水，然后卸下冷凝管；導出上槽中的電泳液，放置于垃圾桶中，然后用長尾夾關閉上槽導液管，緩慢松開固定螺絲，卸下玻璃板；
B-(15)小心剝離步驟B-(14)的耳板，將帶膠大板，放入白瓷盤中，記好順序，倒入考馬斯亮藍R-250染色液，配方見表6，染色；
6.考馬斯亮藍R-250染色液配方
B-(16)步驟B-(15)染色結束后，將膠板放置到新的盒子中，記錄順序，小心加入清水，10-30min后換水，隨時觀察，及時拍照。
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