[發明專利]基于單粒醇溶蛋白提取和檢測技術的谷子雜交種純度鑒定方法

有效

• 申請號: 201911044806.X
• 申請日: 2019-10-30
• 公開（公告）號: CN110669120B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 劉丹;劉正理;李承宗;崔燕嬌;李強;王建賀;梁丹;李素英;曹婷婷;趙子龍
• 申請（專利權）人: 天津市農作物研究所（天津市水稻研究所）;唐山師范學院
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/14;C07K1/30;G01N27/447
• 代理公司: 石家莊輕拓知識產權代理事務所(普通合伙) 13128
• 代理人: 張培元

本發明公開了一種基于單粒醇溶蛋白提取和檢測技術的谷子雜交種純度鑒定方法，通過采用多溶劑復配的醇溶蛋白提取液提升單粒谷子種籽中醇溶蛋白的溶解度和提取效率；通過提高膠濃度到15％以上實現對谷子醇溶蛋白的充分攔截，通過提高硫酸亞鐵和雙氧水用量以提高氧化還原反應的速度和力度以增加凝膠強度并減少膠在起板的過程中的損傷率，使得醇溶蛋白帶譜足量清晰顯現；最后讀取帶譜完成谷子雜交種純度的鑒定。

技術領域

本發明涉及生物分子檢測和鑒定技術領域，具體涉及一種單粒谷子種子醇溶蛋白的提取、檢測方法及其應用。

背景技術

近年谷子雜種優勢利用研究也取得了較大成績，如張家口農科院選育的“張雜谷5號”于2007年創造了小面積畝產810.6公斤的我國春谷高產記錄，唐山師范學院選育的“5695”創造了小面積實打畝產765.5公斤的夏谷高產記錄。但是，由于谷子雜交種是兩系雜交種，亦即只有母本-不育系和父本-恢復系，沒有保持系，母本不育系并非100％不育，而是具有5％左右的自交結實特性，且可以穩定遺傳，其不育性的保持就是通過其自身5％左右的自交結實特性進行的。然而，谷子雜交種親本的這些特性造成其種子中總是混有一定的不育系，且由于授粉和收獲等原因，還會混有一定的恢復系，乃至其他材料。鑒于此，為保證雜交種的增產效果，在谷子雜交種試驗、示范、推廣過程中，首先要考慮如何去除雜交種中混雜的不育系、恢復系等雜株，因此，必須先鑒定雜交種的純度，確定谷子雜交種適宜的播種量，而這也是品種管理的重要依據和管理環節。如何鑒定谷子雜交種的純度，確定適宜的播種量，成為制約谷子雜交種推廣以及品種管理方面的一大技術難題。

20世紀90年代以前，谷子雜交種鑒定主要通過父母本苗色的差別，選用苗色深的材料做父本，以苗色較淺的不育系為母本，依據深顏色對淺顏色為顯性的遺傳規律，雜交種與父本顏色相同，通過拔除雜交種中混雜的顏色較淺的母本，去除雜株，也通過調查其中顏色較淺的不育株的比例確定雜交種的純度，這一方法雖然能去除雜交種中的部分雜株，但限制顏色較深的不育系的應用，且費工費時，不能去除雜交種中混雜的恢復系和其它材料，鑒定的純度也不準確。

20世紀90年代以后，隨著抗除草劑材料的引進、創制成功，通過培育抗除草劑的恢復系，而不育系不抗除草劑，利用抗除草劑性狀為顯性遺傳的特性，通過苗期噴施除草劑殺除其中假雜種，來鑒定雜交種的純度、去除假雜種，這一方法，使各種苗色的不育系均能獲得應用，但仍不能鑒定出雜交種混雜的恢復系或其它抗除草劑材料，仍不能徹底去除雜交種中的假雜種，也不能準確的鑒定雜交種的純度。因此，創造一種能夠準確鑒定雜交種純度的方法成為對谷子雜交種進行品種管理、保證其增產效果的當務之急。

利用分子標記構建作物品種的指紋圖譜，是目前常用的雜交種乃至品種常用的鑒定方法，但是這種方法需要使用較多的典型引物，且要求引物多態性較好，否則，構建的品種指紋圖譜不夠準確，也難以準確的鑒定雜交種的純度，同時該方法還需要經過育苗、DNA提取、電泳、讀帶等過程，操作復雜，鑒定時間長，不適合大批量的進行雜交種純度鑒定。

醇溶蛋白是禾本科作物種子中的一種主要的貯藏蛋白，是種子萌發時C和N的主要來源^[1,2]。其電泳帶譜完全受基因型控制，不受環境條件影響，且遺傳變異豐富,在品種間存在著穩定的多態性，可作為品種的“指紋”^[3]。同時，其多態性檢測不需要育苗、DNA提取、聚合酶鏈式反應等環節，操作簡單，已在小麥、水稻等作物品種鑒定、純度分析、種質資源的鑒定評價、物種遺傳多樣性研究等方面廣泛應用^[4]；國際種子檢驗協會已把小麥醇溶蛋白帶譜鑒定作為標準方法用于小麥種子的純度鑒定^[5]，因此，醇溶蛋白在品種的真假和純度鑒定中的作用越來越受到科研人員的重視。