[發明專利]利用分子伴侶構建的吡喃糖氧化酶基因、蛋白、畢赤酵母菌及制備和應用

在審

• 申請號: 201911033580.3
• 申請日: 2019-10-28
• 公開（公告）號: CN110628790A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 董聰;王玥;高慶華;王慶慶;羅同陽;馬清河;馬金國
• 申請（專利權）人: 河北省微生物研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 13101 石家莊海天知識產權代理有限公司
• 代理人: 田文其

1.利用分子伴侶構建的吡喃糖氧化酶基因，其特征在于其基因序列為SEQ ID No.1。

2.利用分子伴侶構建的吡喃糖氧化酶基因的制備方法，其特征在于包括如下工藝步驟：

A、構建質粒與菌株

將巴斯德畢赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.16552制備成感受態；

B、分子伴侶基因克隆

根據伴侶蛋白Ero1、PDI、CNE1和SEC53基因序列設計寡核苷酸鏈，合成引物，以畢赤酵母Phchia pastoris CGMCC No.16552基因組為模板，通過PCR技術利用引物以畢赤酵母的基因組為模板分別擴增出Ero1、PDI、CNE1和SEC53基因序列，引物具體如下：

ERoI-F：5'-ctatttcgaaacgatgaggatagtaaggagcgtagctatc-3'，其中下劃線為BstBI酶切位點；

ERoI-R：5'-ataagaatgcggccgcttacaagtctactctatatgtggtatc-3'，其中下劃線為NotI酶切位點；

PDI-F：5'-ctatttcgaaacgatgcaattcaactgggatattaaaactg-3'，其中下劃線為BstBI酶切位點；

PDI-R：5'-ataagaatgcggccgctaaagctcgtcgtgagcgtctgcctc-3'，其中下劃線為NotI酶切位點；

CNE1-F：5'-ctatttcgaaacgatgaagatctctaccattgcaag-3'，其中下劃線為BstBI酶切位點；

CNE1-R：5'-ataagaatgcggccgctaggttctctttgtagctttagtc-3'，其中下劃線為NotI酶切位點；

SEC53-F：5'-ctatttcgaaacgatgtcgttttctaataaagaagatc-3'，其中下劃線為BstBI酶切位點；

SEC53-R：5'-ataagaatgcggccgcttacagggaaaagagctcct-3'，其中下劃線為NotI酶切位點；

PCR反應共30個循環，PCR反應體系如下：Q5聚合酶1μl，5×Buffer20μl，5×GC enhance20μl，上、下游引物各4μl，濃度為l0mM的dNTP 2μl，畢赤酵母基因組模版4μl，ddH₂O添加至100μL；

雙酶切純化后將Ero1、PDI、CNE1和SEC53的成熟片段與分別同樣雙酶切的pPICZ載體連接，構建克隆載體pPICZ-EroⅠ、pPICZ-PDI、pPICZ-CNE1和pPICZ-SEC53，轉化E.coliT1感受態細胞，挑取單克隆進行PCR，酶切鑒定和基因測序，獲得正確的融合載體；

C、重組質粒的構建

重組質粒pPICZ-PDI的構建方法：在pPICZ載體的BstB I和Not I酶切位點之間插入了PDI基因的雙鏈分子；重組質粒pPICZ-EroⅠ的構建方法：在pPICZ載體的BstB I和Not I酶切位點之間插入了EroⅠ基因的雙鏈分子；重組質粒pPICZ-CNE1的構建方法：在pPICZ載體的BstB I和Not I酶切位點之間插入了CNE1基因的雙鏈分子；重組質粒pPICZ-SEC53的構建方法：在pPICZ載體的BstB I和Not I酶切位點之間插入了SEC53基因的雙鏈分子。

3.利用吡喃糖氧化酶基因編碼的蛋白，其特征在于其序列為SEQ ID No.2。

4.利用吡喃糖氧化酶基因轉化的巴斯德畢赤酵母，其特征在于其拉丁文分類命名為Phchia pastoris，其保藏編號為CGMCC No.18464。

5.根據權利要求4所述的巴斯德畢赤酵母在制備吡喃糖氧化酶中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于包括如下工藝步驟：

挑取保藏編號為CGMCC No.18464的巴斯德畢赤酵母接種于5ml的YPD液體培養基培養10小時，按3％接種量轉接于150mL的BMGY培養基至OD₆₀₀≈6接種于發酵罐中，容積為10L發酵罐的裝液量為5.4L的BSM培養基，滅菌后以10％發酵體積接種，以濃氨水控制pH＝5.0，培養溫度30℃，培養階段甘油耗盡時，開始流加體積百分比濃度為50％甘油4h后至OD₆₀₀≈180，停止流加甘油；待培養基中甘油耗盡，開始流加甲醇誘導，甲醇溶液的體積百分濃度為1％，期間每隔24h加Vc水溶液至終濃度80μg/L，每12h取樣測定發酵液酶活，當酶活不再升高時停止發酵。