[發明專利]一種提高水稻單堿基編輯效率的基因、方法及應用

有效

• 申請號: 201911029085.5
• 申請日: 2019-10-28
• 公開（公告）號: CN112725348B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 李娟;魏鵬程;秦瑞英;許蓉芳;李浩;劉小雙;徐善斌
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/55;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理有限公司 11457
• 代理人: 黃云鐸

本發明提供了一種提高水稻堿基編輯效率的基因、方法及其應用。本發明合成了一種含抗潮霉素蛋白的編碼基因HPT、SpCas9蛋白的編碼基因SpCas9n和腺嘌呤脫氨酶編碼基因ABE的共轉錄單元ABEHPT，還提供包含該ABEHPT的一種表達載體，以及表達載體在水稻基因單堿基編輯方面的應用。將表達載體導入植物體內后，能同時轉錄和翻譯ABE堿基編輯器和潮霉素基因，通過潮霉素篩選，提高植物細胞中ABE堿基編輯器表達量，從而提高植物細胞中ABE堿基編輯效率。實驗證明，利用本發明設計的ABEHPT基因構建植物表達載體，進而構建水稻打靶載體，導入水稻細胞后造成水稻特異基因位點的DNA上的A:T突變成G:C定點替換的效率大幅提升，在高效獲得單堿基替換植株方面具有重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種提高水稻單堿基編輯效率的基因、方法及應用。

背景技術

基因編輯技術是近年來取得突破性進展的顛覆性技術之一。CRISPR/Cas9基因編輯系統簡便、高效，被廣泛應用于基因功能研究和利用。盡管CRISPR/Cas9可以高效靶向目的基因，但其定點修飾依賴于效率低下的同源重組機制，因此精準編輯基因的能力有待提高。單堿基編輯技術(base editor，BE)通過將Cas9切口酶(Cas9 nikase,Cas9n)或無核酸酶活性的Cas9(nuclease dead Cas9,dCas9)與胞嘧啶脫氨酶形成融合蛋白，并通過sgRNA(單鏈向導RNA)將融合蛋白靶向靶位點，在不切割雙鏈DNA的情況下對靶基因位點的單個堿基進行胞嘧啶C→胸腺嘧啶T或鳥嘌呤G→腺嘌呤A的精準編輯。現有編輯器可分為介導C:G突變成T:A定點替換的胞嘧啶堿基編輯器(cytidine base editor,CBE)，以及A:T突變成G:C定點替換的腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor,ABE)。目前最為常見的CBE和ABE系統分別是BE3和ABE7.10系統。

大量的植物全基因組關聯性(GWAS)分析研究已經表明，許多重要的農藝性狀與單堿基變異密切相關。因此，單堿基編輯技術已在植物、動物以及人細胞中進行了高效的基因定點突變，在農業、生物醫學研究甚至基因治療中有廣泛的應用前景。目前該系統仍然存在一定的缺陷，如在植物中堿基編輯效率低下。目前植物堿基編輯系統的優化工作開展較少，而且堿基編輯的效率提升有限。

發明內容

傳統的植物基因堿基編輯系統是通過瞬時或穩定遺傳轉化方式，將編輯體系導入植物細胞中。在穩定遺傳轉化過程中，所用的抗篩選劑基因都是組成型表達，而且堿基編輯器基因同樣是組成型表達，但是兩者都有各自的表達框。這就有可能出現：在篩選過程中，強表達抗篩選劑基因的細胞中的堿基編輯器表達量不高的情況。

針對植物中A:T突變成G:C定點替換的腺嘌呤堿基編輯器ABE堿基編輯效率低下的突出問題，考慮到堿基編輯器表達不充分可能是造成其基因編輯效率不足的因素之一，本發明的目的通過提高植物體內ABE編輯器蛋白水平來提高ABE堿基編輯效率。

具體而言，本發明提供一種提高水稻單堿基編輯效率的共轉錄單元基因ABEHPT，其特征在于，所述共轉錄單元基因ABEHPT包括抗潮霉素蛋白的編碼基因HPT、SpCas9蛋白的編碼基因SpCas9n和腺嘌呤脫氨酶的編碼基因ABE，其中，所述共轉錄單元基因ABEHPT與sgRNA的編碼基因構建于同一表達載體中。

優選地，所述共轉錄單元基因ABEHPT的各個基因片段插入到同一表達框內，并且其連接sgRNA編碼基因后的序列至少包含：

(a)序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；或者

(b)在序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸且能夠進行水稻基因組剪切的核苷酸序列；或者

(c)在序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸且能夠進行水稻基因組剪切的核苷酸序列；或者