[發(fā)明專利]一種提高水稻單堿基編輯效率的基因、方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201911029085.5
• 申請日: 2019-10-28
• 公開（公告）號: CN112725348B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李娟;魏鵬程;秦瑞英;許蓉芳;李浩;劉小雙;徐善斌
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/55;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京律譜知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11457
• 代理人: 黃云鐸

1. 一種提高水稻單堿基編輯效率的共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT，其特征在于，所述共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT包括抗潮霉素蛋白的編碼基因HPT、SpCas9蛋白的編碼基因SpCas9n和腺嘌呤脫氨酶的編碼基因ABE，其中，所述共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT與sgRNA的編碼基因構(gòu)建于同一表達載體中，所述共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT的各個基因片段插入到同一表達框內(nèi)，共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT的序列為：序列表中SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列。

2.一種提高水稻單堿基編輯效率的方法，其特征在于，所述方法包括將sgRNA的編碼基因、抗潮霉素蛋白的編碼基因HPT、SpCas9蛋白的編碼基因SpCas9n和腺嘌呤脫氨酶的編碼基因ABE導入受體中，使sgRNA、抗潮霉素蛋白、SpCas9蛋白和腺嘌呤脫氨酶在受體中表達，從而對受體基因組中的靶基因進行堿基編輯，所述方法還包括合成含有所述抗潮霉素蛋白的編碼基因HPT、SpCas9蛋白的編碼基因SpCas9n和腺嘌呤脫氨酶編碼基因ABE的基因序列ABEHPT，并兩端加有NotI/SacI 酶切位點，利用NotI/SacI酶切植物表達載體pHUN900載體并回收，將基因序列ABEHPT連接到表達載體，利用酶切位點將載體上的啟動子連同基因序列ABEHPT切下，連入不含有篩選標記基因HPT的植物表達載體，合成含有HindIII酶切位點的sgRNA表達框，將其導入所述植物表達載體，再將所述植物表達載體導入受體，所述抗潮霉素蛋白的編碼基因HPT、SpCas9蛋白的編碼基因SpCas9n和腺嘌呤脫氨酶編碼基因ABE使用同一個組成型啟動子Ubiqutin和同一個35S終止子，ABEHPT的序列為：序列表中SEQ IDNo.1中所示的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高水稻單堿基編輯效率的方法，其特征在于，sgRNA表達框包括：水稻OsU3啟動子、壯觀霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T終止子，其中，所述水稻OsU3啟動子的核苷酸序列如Seq ID No.2第1至382位所示，壯觀霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.2第388至1595位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.2第1603至1688位所示，Poly-T終止子的核苷酸序列如Seq IDNo.2第1689至1696位所示。

4.一種植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體包含權(quán)利要求1中所述的共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT，和sgRNA表達框，所述sgRNA表達框包括：水稻OsU3啟動子、壯觀霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T終止子，其中，所述水稻OsU3啟動子的核苷酸序列如Seq ID No.2第1至382位所示，壯觀霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.2第388至1595位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.2第1603至1688位所示，Poly-T終止子的核苷酸序列如Seq ID No.2第1689至1696位所示。

5.一種權(quán)利要求1中所述的共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT的應用，其特征在于，所述應用包括將所述共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT經(jīng)過侵染、共培養(yǎng)、篩選步驟導入植物愈傷組織，得到編輯后的植物愈傷組織。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述應用包括將所述植物愈傷組織分化成植株，利用所述共轉(zhuǎn)錄單元基因ABEHPT，提高水稻基因組上的A:T 突變成G:C的定點替換效率，獲得含有突變位點的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分。