[發明專利]一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液及冷凍方法

在審

• 申請號: 201910998213.0
• 申請日: 2019-10-21
• 公開（公告）號: CN110604128A
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 張廣志
• 申請（專利權）人: 內蒙古金草原牧業有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 13130 石家莊領皓專利代理有限公司
• 代理人: 薛琳

本發明屬于胚胎學技術領域，提出了一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液及冷凍方法，所述冷凍保存液由以下重量份的組分組成：HPES緩沖液40～50份，牛血清白蛋白0.1～0.5份，山梨糖醇2～5份，谷氨酰胺0.01～0.02份，聚乙烯亞胺10～15份，蔗糖20～25份。肉牛繁殖胚胎冷凍方法，包括下述步驟：將準備冷凍的牛胚胎先在預平衡液中平衡5～8min，再放入權利要求1～3任意一項所述的一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液中平衡30～40秒后轉移至冷凍載體上，將冷凍載體投入液氮中進行冷凍。通過上述技術方案，解決了現有技術中冷凍保存液對細胞的冷凍保存效果不好，導致細胞的冷凍存活率低的問題。

技術領域

本發明屬于胚胎學技術領域，涉及一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液及冷凍方法。

背景技術

胚胎冷凍保存就是將動物的早期胚胎，采用特殊的保護劑和降溫措施進行冷凍，使其在-196℃的液氮中代謝停止或者減弱到足夠小的程度，但又不失去升溫后恢復代謝的能力，從而能長期保存胚胎的一種生物技術。牛胚胎冷凍保存是由Wilmut在1973年獲得成功的。牛胚胎冷凍方法根據降溫方法的不同，可以分為緩慢降溫法和玻璃化冷凍法。緩慢降溫法是指將用冷凍保護劑處理過的胚胎，利用由計算機控制降溫速度的胚胎冷凍儀，首先從室溫以-1.0℃/min的速度降溫至植冰溫度-7℃，保持10min，植冰后再以-0.3℃/min的速度降溫至-30℃，然后直接投入液氨中長期保存。這種緩慢的降溫方法可以防止細胞內結冰或減少冰晶的形成。植冰即誘發結晶，可以有效防止過冷現象對胚胎造成的危害。玻璃化冷凍法是將胚胎用冷凍保護劑處理后，直接投入液氮長期保存。其原理是高濃度的冷凍保護劑在冷卻時粘滯性增加，當達到臨界值時固化。

無論是緩慢降溫法還是玻璃化冷凍法，都必須添加冷凍保護劑。冷凍保護劑可以與水結合，避兔或減少結冰的程度與速度，或僅結成較小的冰晶，同時冷凍保護劑可以降低冷凍過程中由于鹽濃度升高而造成的溶質損傷。根據冷凍保護劑能否滲入細胞而將它們分為兩類:--類是滲透性保護劑,這類化合物多為低分子化合物，能透過細胞膜，在高的分子濃度下快凍，尤其是慢凍時能保護細胞。這類保護劑主要包括甘油、二甲基亞楓、丙二醇、乙二醇、葡萄糖等；另一類是非滲透性保護劑，主要有蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。其作用的主要特點是在較快的冷凍及解凍速度中更有效的保護細胞。目前一般多采用聯合使用兩種以上冷凍保護劑組成冷凍保存液。但是，現有的冷凍保存液對細胞的冷凍保存效果不好，導致細胞的冷凍存活率低。因此，需要對冷凍保存液進行改進，以提高細胞的冷凍存活率。

發明內容

本發明提出一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液及冷凍方法，解決了現有技術中冷凍保存液對細胞的冷凍保存效果不好，導致細胞的冷凍存活率低的問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液，所述冷凍保存液由以下重量份的組分組成：

HPES緩沖液40～50份，牛血清白蛋白0.1～0.5份，山梨糖醇2～5份，谷氨酰胺0.01～0.02份，聚乙烯亞胺10～15份，蔗糖20～25份。

作為進一步的技術方案，由以下重量份的組分組成：

HPES緩沖液45份，牛血清白蛋白0.3份，山梨糖醇3份，谷氨酰胺0.015份，聚乙烯亞胺12份，蔗糖23份。

作為進一步的技術方案，所述聚乙烯亞胺的分子量為70000。

一種肉牛繁殖胚胎冷凍方法，包括下述步驟：將準備冷凍的牛胚胎先在預平衡液中平衡5～8min，再放入權利要求1～3任意一項所述的一種肉牛繁殖胚胎冷凍保存液中平衡30～40秒后轉移至冷凍載體上，將冷凍載體投入液氮中進行冷凍。

作為進一步的技術方案，在將在預平衡液中平衡5～8min后的牛胚胎放入所述冷凍保存液中前，先將所述冷凍保存液預熱至37～40℃。

作為進一步的技術方案，所述冷凍載體為OPS。