[發明專利]諾如病毒的檢測方法

在審

• 申請號: 201910995901.1
• 申請日: 2019-10-18
• 公開（公告）號: CN111254217A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 小林慎一郎;四方正光;二宮健二;高岡直子
• 申請（專利權）人: 株式會社島津制作所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

提供一種諾如病毒的檢測方法。本發明涉及利用逆轉錄?聚合酶鏈式反應(reverse transcription?polymerase chain reaction、RT?PCR)檢測諾如病毒的方法、以及用于實施該方法的試劑盒。更具體而言，涉及將待檢體處理液和RT?PCR反應液的混合液與待檢體混合來檢測諾如病毒的方法、以及用于實施該方法的試劑盒，前述混合液還包含二甲基亞砜。

技術領域

本發明涉及利用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerasechainreaction、RT-PCR)檢測諾如病毒的方法、以及用于實施該方法的試劑盒。更具體而言，將待檢體處理液和RT-PCR反應液的混合液與待檢體混合來檢測諾如病毒的方法、以及用于實施該方法的試劑盒，所述混合液還包含二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide、DMSO)。

背景技術

諾如病毒是屬于人杯狀病毒(human calicivirus)科的RNA病毒，基因組中具有約7000個堿基的單鏈RNA。該病毒是按照用電子顯微鏡觀察到的形態學分類也被稱為小圓形結構病毒(Small Round Structured Virus,SRSV)、且以諾沃克樣病毒(Norwalk-likevirus)這樣的屬名所稱呼的病毒。屬于諾如病毒的病毒被分類為基因組(genogroup)(GI)和基因組II(GII)這2種基因組，進而分別被分類為14和17或更多的基因型(genotype)。

人感染諾如病毒時會引起嘔吐、痢疾等急性胃腸炎癥狀。日本國內每年的食物中毒患者的約半數起因于諾如病毒，其中的約7成發生在11月～2月，諾如病毒作為冬季型的胃腸炎和食物中毒的原因病毒而已知。由諾如病毒導致的食物中毒主要由通過烹飪者的食品污染而產生。諾如病毒的感染性強、容易產生大規模的食物中毒等群體事件。對于人的感染途徑主要是經口感染。感染者的糞便或嘔吐物以及被它們直接或間接地污染的物品類、或者被諾如病毒污染的牡蠣或者其他的雙殼貝類等食品類作為代表性的感染源而被列舉。因此，鑒定諾如病毒感染患者、由該病毒導致的污染物對于防止病毒感染的擴大是重要的。

作為用于檢測由病毒導致的感染、污染的病毒檢查，應用檢測病毒抗原的免疫學的測定法、病毒基因擴增法(專利文獻1～3、非專利文獻1)。作為高靈敏度地檢測諾如病毒的手段，可列舉出用RT-PCR擴增諾如病毒的RNA、測定擴增產物量的方法。例如，根據厚生勞動省藥品食品局食品安全部監視安全課的通知(非專利文獻2和3)，廣泛地利用RT-PCR法進行諾如病毒的檢測以及利用實時PCR法進行諾如病毒的定量檢測。

RNA病毒粒子具有由RNA基因組與蛋白質形成的核被封入被稱為衣殼的蛋白質殼中而成的基本結構。因此，為了利用基因擴增法檢測病毒RNA，需要從病毒粒子中提取RNA。為了檢測作為待檢體的糞便中的諾如病毒，例如，將糞便待檢體以5～10％(w/v)的濃度懸浮于蒸餾水或生理鹽水中，由其離心上清，使用市售的病毒RNA提取試劑盒(例如，QIAamp(注冊商標)Viral RNA Mini、QIAGEN公司)提取/純化RNA(非專利文獻2)。然而，在多階段的RNA提取·純化操作之后進行RT-PCR的檢測過程是復雜的。因此，提出了將糞便懸浮液與待檢體處理液混合、進行短時間熱處理來去除殼蛋白，使內部的RNA游離，將游離的RNA直接供于RT-PCR的簡易的檢測法(非專利文獻4)。另一方面，為了對糞便懸浮液與待檢體處理液的混合物進行熱處理，需要做以下的工作：為了防止該混合物的暴沸、蒸發而用蓋子對反應容器進行密閉，熱處理之后卸下蓋子，添加RT-PCR反應液。為了改善這一點，提出了將待檢體與胍鹽等離液劑混合，不必進行熱處理而利用RT-PCR來檢測病毒的方法(專利文獻4)。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：WO2002/029119

專利文獻2：WO2002/029120

專利文獻3：日本特開2004-301684