[發明專利]修飾的脫氧核酶及其用途

有效

• 申請號: 201910981921.3
• 申請日: 2019-10-16
• 公開（公告）號: CN112662667B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發明（設計）人: 何軍林;史衛國;肖軍海;杜閃閃;李陽;柴智龍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/25;A61K48/00
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 蘇紅梅

本發明涉及一種經修飾的脫氧核酶或其衍生物，該脫氧核酶或其衍生物具有更高催化效率和金屬離子選擇性。還涉及所述脫氧核酶或其衍生物在制備用于檢測金屬離子的傳感器或芯片中的用途，以及在制備基因治療藥物中的用途。

技術領域

本發明涉及修飾的脫氧核酶及其用途。

背景技術

8-17脫氧核酶是一個從核酸序列庫篩選而來的具有催化功能的核酸DNA分子，其結構式如圖1中(A)所示[Santoro,S.W.and Joyce,G.F.(19.97)A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94,4262–4266.]，它能催化裂解互補RNA的特定磷酸二酯鍵，例如切割圖1中靶RNA序列中的GA連接。其他類似的脫氧核酶結構如圖1中(B)所示，屬于8-17脫氧核酶家族。8-17脫氧核酶家族的催化反應都有賴于金屬離子的參與，因而是金屬離子依賴的脫氧核酶。這類脫氧核酶的結構域有15-16個堿基，分別為T21，三個堿基對組成的莖部結構(stem)，A6G7C8組成的末端環狀結構(end loop)和A12C13G14A15組成的大環結構(bulge loop)。8-17脫氧核酶家族成員的區別在于大環結構的不同，因而賦予它們不同的金屬離子依賴性和催化活性。例如，被Ca²⁺和Mg²⁺所活化的脫氧核酶Mg5，結構區別在于W＝A,R＝A,和A16)[Peracchi,A.(2000)Preferentialactivation of the 8–17deoxyribozyme by Ca²⁺ ions.J.Biol.Chem.,275,11693–11697.]，Zn²⁺-依賴的脫氧核酶17E，其結構式如圖1(C)所示，結構區別在于W＝T,R＝A,和A16.1[Li,J.,Zheng,W.,Kwon,A.H.and Lu,Y.(2000)In vitro selection andcharacterization of a highly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleavingdeoxyribozyme.Nucleic Acids Res.,28,481–488.]。

這類脫氧核酶的潛在用途包括兩大類。一類是基于這些脫氧核酶的催化反應依賴于金屬離子，所以發展了基于這些脫氧核酶的生物傳感器，測定某些金屬離子在特定人細胞內的含量，在環境、食品等物質中的含量，是目前正在大力發展的一類傳感器。另一類是基于它們對于互補RNA的裂解，用于致病性RNA的裂解，作為基因治療的候選藥物，致病性RNA包括病毒和細菌的RNA，各種疾病發生發展過程中過表達的RNA(轉移RNA，各種小RNA等)。因此，提高這類脫氧核酶的催化能力和對于金屬離子的選擇性是實現其潛在應用價值的關鍵所在。

提高這類脫氧核酶的催化能力和金屬離子的選擇性主要有兩個策略，一是繼續篩選新的核酸庫，并對核酸庫進行改造，但因為修飾核苷酸在篩選過程中的循環復制效率低于天然核苷酸，目前所獲得的新型脫氧核酶比較少，其催化能力也有限。另一種方法是對已有的脫氧核酶進行化學改造。就8-17脫氧核酶系列而言，文獻報道的化學修飾主要是四個天然堿基的替換，結構修飾較少，沒有獲得更高催化效率的新結構。但基于這些修飾，獲得了對于催化結構域的認識。

對于8-17和17E兩個脫氧核酶的催化結構域進行了突變修飾，即用天然堿基替換每個堿基，根據其對于脫氧核酶催化活性的影響，表明T2.1，A6G7C8和C13G14是高度保守的堿基，它們的突變或者缺失導致催化活性的完全喪失，只有C8被T的取代帶來的損失較小，為5-10倍的損失[Peracchi,A.,Bonaccio,M.and Clerici,M.(2005)A mutationalanalysis of the 8–17 Deoxyribozyme core.J.Mol.Biol.,352,783–794.]。因為催化效率的提高和對于金屬離子的選擇性都是決定傳感器靈敏度和基因治療藥物效價的關鍵因素，但目前還沒有報道更好的修飾方法。