[發(fā)明專利]一種快速篩選基因編輯素材的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910980345.0
• 申請日: 2019-10-15
• 公開（公告）號: CN110771513B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李雪梅;米其利;宋春滿;李晶;孔維松;高茜;劉欣;許永;黃海濤;曾婉俐;向海英;許力;管瑩;蔣佳芮;楊光宇
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: A01H5/04
• 分類號: A01H5/04;G01N33/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

本發(fā)明公開了一種快速篩選基因編輯素材的方法，本方法是通過采集水培環(huán)境下、同批次移栽的基因編輯素材和對照親本煙株的現(xiàn)蕾期新鮮煙葉；制備煙葉粉末后根據(jù)基因編輯位點檢測靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分；基于三步法確定對照親本組樣本中靶標(biāo)代謝物的含量范圍；采用區(qū)間分析法，將基因編輯素材靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量與對照親本組樣本中靶標(biāo)代謝物的含量范圍進行比對和顏色填充標(biāo)識，從而獲得靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量高于或低于對照親本組的基因編輯素材；本發(fā)明實現(xiàn)了基于靶標(biāo)化學(xué)成分含量變化，對水培種植環(huán)境下海量基因編輯素材的快速且較為準(zhǔn)確篩選，為加快獲得煙草優(yōu)良品種提供技術(shù)支持。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對海量基因編輯素材進行快速篩選的方法，為加快獲得煙草優(yōu)良品種提供技術(shù)支持。

背景技術(shù)

基因編輯育種技術(shù)被廣泛用于農(nóng)作物優(yōu)良新品種的高效、準(zhǔn)確選育，例如水稻、玉米和煙草等。在煙草基因編輯育種過程中，為了滿足海量編輯素材對規(guī)模化種植的需求，并保證栽培條件、管理技術(shù)等的統(tǒng)一可控，建立了編輯素材的水培車間。同時，為了加速編輯素材的篩選，對水培車間的編輯素材采用了早花技術(shù)，獲得的栽培煙株比較低矮、葉片較小而且比較薄。長期以來，煙草品種的選育，一般先開展經(jīng)濟性狀和外觀等級等農(nóng)業(yè)性狀的篩選，再對成熟采摘后烘烤、醇化的煙葉按照工業(yè)需求進行感官品質(zhì)、配方適應(yīng)性、有害成分釋放等的篩選，以同時滿足農(nóng)業(yè)和工業(yè)兩方面的需求。目前，煙草基因編輯工廠化育種，由于采用水培種植和早花技術(shù)，獲得的編輯煙株矮小，而且葉片數(shù)少、葉面積較小，與田間生長狀況差異較大，除了嚴(yán)重表型缺陷，無法對這些編輯素材進行農(nóng)業(yè)性狀篩選，更無法用如此少量的煙葉進行烘烤或醇化從而進行工業(yè)需求的篩選。

因此，如何對水培種植條件下海量基因編輯素材進行高效精準(zhǔn)的篩選成為煙草基因編輯工廠化育種亟待解決的重要問題之一。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種快速篩選基因編輯素材的方法，該方法能夠基于靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量變化的判定，實現(xiàn)水培種植環(huán)境下海量基因編輯素材的快速、準(zhǔn)確篩選，為煙草優(yōu)良品種的加快獲得提供技術(shù)支持。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

(1)在水培種植環(huán)境條件下，采用相同的栽培技術(shù)對同批次移栽的基因編輯素材和對照親本進行管理，栽培至植株的現(xiàn)蕾期，獲得栽培條件一致的基因編輯煙株和對照親本煙株；其中，對照親本煙株的栽培數(shù)量≥30株，基因編輯素材包括T0 代至Tn代的煙株；

(2)采集現(xiàn)蕾期的基因編輯素材和對照親本的新鮮煙葉，即刻冷凍干燥、粉碎，獲得煙葉粉末；

(3)根據(jù)基因編輯位點及其生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，確定素材待測的靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分，采用煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的或?qū)嶒炇易越ǖ姆椒ㄩ_展煙葉粉末中靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分的檢測；

(4)基于三步法，確定對照親本的靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量范圍：首先采用四分位數(shù)極差(IQR)法進行對照親本檢測數(shù)據(jù)中離群值的檢驗與剔除；然后對剔除離群值的數(shù)據(jù)，采用Shapiro-Wilk檢驗法進行分布檢驗，符合正態(tài)分布則對照親本成立；最后，采用95％置信區(qū)間法進行對照親本的靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量范圍的確定；

(5)采用區(qū)間分析法，將基因編輯素材中靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分的含量與對照親本的靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量范圍進行比對；在相應(yīng)的數(shù)據(jù)表格中采用背景顏色填充進行區(qū)分標(biāo)識：在對照親本靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量范圍內(nèi)的基因編輯素材檢測數(shù)據(jù)采用綠色背景標(biāo)記；高于對照親本靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量范圍的基因編輯素材檢測數(shù)據(jù)采用紅色背景標(biāo)記；低于對照親本靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量范圍的基因編輯素材檢測數(shù)據(jù)采用藍色背景標(biāo)記；通過篩選背景顏色(紅色和藍色)，獲得靶標(biāo)代謝物化學(xué)成分含量高于或低于對照親本的基因編輯素材。