[發(fā)明專利]遞送外源RNP的慢病毒載體及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910979334.0
• 申請(qǐng)日: 2019-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110684804B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡宇伽;凌思凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海本導(dǎo)基因技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867
• 代理公司: 上海段和段律師事務(wù)所 31334
• 代理人: 郭國(guó)中

1.一種遞送外源RNP的慢病毒載體，所述慢病毒載體是通過(guò)將含有慢病毒載體基因組序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入病毒生產(chǎn)細(xì)胞，制備而得；其特征在于，所述慢病毒載體基因組序列分別位于表達(dá)膜蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白的慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)形成RNP所需蛋白質(zhì)的質(zhì)粒和表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白所識(shí)別的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的外源目的RNA的質(zhì)粒上；

所述表達(dá)膜蛋白的質(zhì)粒包括表達(dá)VSV-G膜蛋白的質(zhì)粒；

所述表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白的慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒是將RNA結(jié)合蛋白整合至第三代慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的N-端；所述表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白的慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒序列為?SEQ?ID?NO.5所示；

所述表達(dá)慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒序列為?SEQ?ID?NO.2所示；

所述表達(dá)形成RNP所需蛋白質(zhì)的質(zhì)粒為表達(dá)含外源蛋白質(zhì)SpCas9的質(zhì)粒，其質(zhì)粒序列為?SEQ?ID?NO.8所示；

所述表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白所識(shí)別的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的外源目的RNA的質(zhì)粒是通過(guò)將RNA結(jié)合蛋白所識(shí)別的RNA序列與目的RNA序列融合而得到；所述質(zhì)粒序列為?SEQ?ID?NO.10所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遞送外源RNP的慢病毒載體，其特征在于，所述病毒生產(chǎn)細(xì)胞包括293T、293FT、HEK293。

3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的遞送外源RNP的慢病毒載體的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

S1、將表達(dá)膜蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白的慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)慢病毒GagPol長(zhǎng)鏈蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)形成RNP所需蛋白質(zhì)的質(zhì)粒和表達(dá)含RNA結(jié)合蛋白所識(shí)別的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的外源目的RNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染病毒生產(chǎn)細(xì)胞；

S2、收集含病毒顆粒的上清，通過(guò)高速離心或者HPLC進(jìn)行濃縮，得到含目的RNP的慢病毒顆粒。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的遞送外源RNP的慢病毒載體在制備遞送Cas9或Cas9衍生物與gRNA形成的RNP用于實(shí)現(xiàn)基因編輯或者堿基編輯的產(chǎn)品中的用途。