[發明專利]一種基于熒光聚合物量子點和氧化石墨烯檢測MMP-9的方法

在審

• 申請號: 201910947759.3
• 申請日: 2019-10-08
• 公開（公告）號: CN110702651A
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 吳芳玲;李巧玉;余紹寧
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 31200 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 王潔平

本發明公開了一種基于熒光聚合物量子點和氧化石墨烯檢測MMP?9的方法。本發明將氧化石墨烯?肽段?聚合物量子點納米復合物與含有MMP?9的溶液共同孵育后，采用熒光光度法分析測得MMP?9的濃度；其中：氧化石墨烯?肽段?聚合物量子點納米復合物通過聚合物量子點與含有特定MMP?9切割位點的肽段連接后，再通過靜電吸附與氧化石墨烯結合構建而得；所述含有特定MMP?9切割位點的肽段的氨基酸序列為CCYGPLGLAGRRRKKK。本發明檢測方法檢測靈敏度高，檢測限低；同時采用的檢測試劑制備方法簡單。

技術領域

本發明涉及蛋白酶檢測技術領域，具體的說，涉及一種基于熒光聚合物量子點和氧化石墨烯檢測MMP-9的方法。

背景技術

基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是重要的前列腺癌標記物，簡便、靈敏的MMP-9檢測方法對監測腫瘤擴散轉移至關重要。酶譜法和酶聯免疫吸附(ELISA)是檢測MMP-9的常用方法。然而，這兩種方法步驟復雜，而且非常耗時。近年來，基于氧化石墨烯的熒光共振能量轉移傳感器逐漸發展用于MMP-9的檢測。氧化石墨烯具有優良的猝滅特性，可以通過各種相互作用吸附熒光基團標記的肽段與寡肽，從而通過熒光共振能量轉移猝滅熒光基團的熒光。常用的熒光基團包括有機熒光分子，無機量子點和金屬納米簇，但是熒光易漂白，熒光不穩定，生物相容性不好等限制了這些熒光分子生物應用。新興的聚合物量子點具有超高的熒光亮度，比傳統有機熒光分子高3個數量級，是商用無機量子點的15倍左右。同時，聚合物量子點具有光穩定性好，生物相容性良好等優點，在生物傳感檢測方面展現出巨大的優勢。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于熒光聚合物量子點和氧化石墨烯檢測MMP-9的方法。該檢測方法檢測靈敏度高，檢測限低；同時采用的檢測試劑制備方法簡單。

基于目標檢測物MMP-9，我們設計了一條肽段CCYGPLGLAGRRRKKK，其中區域1是PLGLAG，含有MMP-9特定識別位點G/L，區域2是RRRKKK，可以通過靜電作用吸附在氧化石墨烯表面。首先CCY端與聚合物量子點通過共價作用連接，然后RRRKKK端與氧化石墨烯通過靜電作用連接，最終形成氧化石墨烯-肽段-聚合物量子點納米復合物。無MMP-9存在情況下，納米復合物由于熒光共振能量轉移效應無熒光發射現象，當 MMP-9存在時，它可以特異剪切肽段G/L位點，使得聚合物量子點遠離氧化石墨烯，熒光共振能量轉移消失，納米復合物發熒光。通過分析MMP-9濃度與熒光強度，可以得到熒光強度與MMP-9濃度的線性關系。通過熒光共振能量轉移效應以及MMP-9對肽段特定位點的剪切作用，實現MMP-9的檢測。本發明的技術方案具體介紹如下。

一種基于熒光聚合物量子點和氧化石墨烯檢測MMP-9的方法，將氧化石墨烯-肽段-

聚合物量子點納米復合物與含有MMP-9的溶液共同孵育后，通過熒光光度法分析測得MMP-9的濃度；其中：所述氧化石墨烯-肽段-聚合物量子點納米復合物通過聚合物量子點與含有特定MMP-9切割位點的肽段連接后，再通過靜電吸附與氧化石墨烯結合構建而得；所述含有特定MMP-9切割位點的肽段的氨基酸序列為CCYGPLGLAGRRRKKK。

本發明中，孵育溫度為30℃-40℃。

本發明中，熒光光度法檢測時，激發波長：450nm，發射波長：536nm。

本發明中，氧化石墨烯-肽段-聚合物量子點納米復合物通過下述步驟制得：

1）取2 g肽段溶解在4~10ml二甲基亞砜中，向其中加入0.03~0.08g碳二亞胺和0.04~0.08g琥珀酰亞胺，室溫下反應20~50分鐘，然后，向混合溶液中加入190~210 mg 聚合物量子點，20℃-30℃下搖動、過夜以使肽段共價結合聚合物量子點；最后透析去除多余肽段，剩下的肽段-聚合物量子點溶解于PBS中，凍干后4℃保存；