[發(fā)明專利]嗜幾丁質(zhì)類芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因及其克隆表達與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910945593.1
• 申請日: 2019-09-30
• 公開（公告）號: CN111235133B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設計）人: 姜明國;楊立芳;劉聰;申乃坤;吳家法;黃文善;朱英芝;許劍;王金子
• 申請（專利權）人: 廣西民族大學;廣西綠友農(nóng)生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/26;C12P19/14
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11308
• 代理人: 曹廣生

1.一種嗜幾丁質(zhì)類芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種嗜幾丁質(zhì)類芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1:提取菌株GDMCC?NO:60710的DNA，根據(jù)已構(gòu)建的嗜幾丁質(zhì)類芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄組注釋的幾丁質(zhì)酶基因部分序列，設計引物擴增幾丁質(zhì)酶功能基因，所述引物序列為：

Forwardprimer:5’-CGGGATCCCGAACCGGCCAAAATCGTCGG-3’，

Reverseprimer:5’-CCGCTCGAGGCTGCCTGTTACCACAATATTCG-3’；

應用PCR擴增技術獲得所述幾丁質(zhì)酶基因全長序列,測序驗證目的序列是否正確；

S2:對所述幾丁質(zhì)酶基因進行克隆與轉(zhuǎn)化；

對幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒pET-22b(+)分別進行雙酶切和純化后，將得到的目的片段和pET-22b(+)載體進行連接，得到重組子pET-22b(+)-CHI；

將重組子pET-22b(+)-CHI轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10感受態(tài)細胞中構(gòu)建基因組文庫；菌落電泳進行陽性重組子的驗證，進一步測序驗證目的序列的正確性；

S3:所述幾丁質(zhì)酶的表達與純化；

將上述重組子pET-22b(+)-CHI轉(zhuǎn)化到E.coli?RosettagamiB(DE3)感受態(tài)細胞中，IPTG誘導幾丁質(zhì)酶蛋白的表達，通過SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況；確定工程菌經(jīng)誘導產(chǎn)幾丁質(zhì)酶后，收集菌體，超聲破壁收集粗酶液，對重組酶進行分離純化。

3.一種編碼權利要求1所述嗜幾丁質(zhì)類芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

4.根據(jù)權利要求3所述的編碼基因在降解幾丁質(zhì)方面的應用。