[發(fā)明專利]一種同步定量檢測3種重要蝦類病原的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910932382.4
• 申請日: 2019-09-29
• 公開（公告）號: CN110616279B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周俊芳;李楠英;房文紅;陳琦;李新蒼;王帥杰;王元;符貴紅;趙姝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所;上海市動物疫病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6893;C12Q1/06
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31233
• 代理人: 黃志達(dá);魏峯

本發(fā)明涉及一種同步定量檢測3種重要蝦類病原的試劑盒，所述試劑盒包括同步檢測3種病原(WSSV、EHP和SHIV)的引物。本發(fā)明基于定量PCR檢測方法，不僅檢測靈敏度比普通檢測方法大幅提升，還可以實現(xiàn)同步評估3種病原的感染率與感染程度，適用于對對蝦中3種病原隱性感染的早期監(jiān)測，尤其適用于對取樣量和帶毒量雙低的蝦苗樣品的批量檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蝦類病原檢測領(lǐng)域，特別涉及一種同步定量檢測3種重要蝦類病原的試劑盒。

背景技術(shù)

引進(jìn)品種凡納濱對蝦(Litopenaeus?vannamei)因為生長速度快、適應(yīng)性強，其種苗培育和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在我國得到持續(xù)發(fā)展，成為我國重要水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟品種。然而，隨著混養(yǎng)與集約化等多種模式的開發(fā)和國內(nèi)外蝦類產(chǎn)品與苗種流通的增加，我國凡納濱對蝦病原種類呈現(xiàn)增多趨勢，如白斑綜合征病毒(WSSV)、蝦肝腸胞蟲(EHP)和蝦虹彩病毒(SHIV)等。其中，WSSV等多種病毒所致疾病被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入需要重點防控的動物疫病名錄；EHP和SHIV盡管為近年新發(fā)病原，但是造成的經(jīng)濟損失卻非常嚴(yán)重，已經(jīng)成為蝦類養(yǎng)殖業(yè)的重要威脅。鑒于對蝦病原種類的多樣性、危害嚴(yán)重性以及許多養(yǎng)殖病害的暴發(fā)源于病原對種苗的微量感染等，近年來生物安保育苗技術(shù)在大型對蝦育苗場逐步推廣，通過對苗場生物性危害因素和關(guān)鍵控制點的監(jiān)測、識別與防控，確保苗種的無毒化培育。近幾年在上海、海南和福建等省市幾家大型凡納濱對蝦育苗場對常見病原的檢測結(jié)果表明，EHP、WSSV和SHIV為育苗場內(nèi)主要生物性危害因素，因此，這3種病原為凡納濱對蝦育苗場內(nèi)構(gòu)建生物安保體系的重點監(jiān)測對象。

常規(guī)的病原檢測技術(shù)如組織病理、免疫組化等具有周期長、取樣量大、不能一次確診等缺點，而大型苗場的樣品還具有批次多、檢測量大且取樣量和攜帶病原量均低的特征，因此，快速、靈敏和組織樣品需要量極小的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)適用于對苗種病原的檢測，尤其是靈敏度高的多重或同步定量PCR檢測技術(shù)，既能滿足監(jiān)測中對靈敏度和風(fēng)險程度準(zhǔn)確評估的要求，又能適應(yīng)對檢測的快速、通量化需要，可以為苗場生物安保技術(shù)體系的構(gòu)建和對蝦健康養(yǎng)殖提供良好技術(shù)支撐。目前，還未見一種針對這三種病原可以做到同步定量檢測的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種同步定量檢測3種重要蝦類病原的試劑盒，該試劑盒基于定量PCR檢測方法，不僅檢測靈敏度比普通檢測方法大幅提升，還可以實現(xiàn)同步評估3種病原的感染率與感染程度，適用于對對蝦中3種病原隱性感染的早期監(jiān)測，尤其適用于對取樣量和帶毒量雙低的蝦苗樣品的批量檢測。

本發(fā)明提供了一種同步定量檢測3種重要蝦類病原的試劑盒，所述試劑盒包括如下引物：

EHP上游：5'-GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGT-3'；

EHP下游：5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3'；

WSSV上游：5'-CGACAGACTACTAACTTCAGCCTAT-3'；

WSSV下游：5'-AAGAGGATACCAGATGCTCGTT-3'；

SHIV上游：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

SHIV下游：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

所述3種重要蝦類病原為白斑綜合征病毒(WSSV)、蝦虹彩病毒(SHIV)和蝦肝腸胞蟲(EHP)。

所述試劑盒(20μL)的組分為：2×TB?Green?Premix?Ex?TaqⅡ10μL，上游引物(10μM)0.6μL，下游引物(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，無DNA酶水6.8μL。

所述試劑盒的反應(yīng)程序為：95℃30s預(yù)變性；然后95℃5s，60℃20s，循環(huán)40次。