[發(fā)明專利]一種制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910922212.8
• 申請(qǐng)日: 2019-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN110672686B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周杰;莊妮莎;呂紫瑤;董維亮;薛瑞;姜岷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/30
• 分類號(hào): G01N27/30;G01N27/327
• 代理公司: 上海微策知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31333
• 代理人: 王小穗

1.一種制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法，其特征在于，所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法包括如下步驟：

(1)將FeCl₃、K₃[Fe(CN)₆]溶于50mL含有HCl與KCl的溶液中；

(2)步驟(1)獲得的溶液通氬氣8～12min；

(3)直徑為2mm的裸玻碳電極經(jīng)氧化鋁粉末打磨拋光處理，所述氧化鋁粉末的直徑包括0.3μm和0.05μm，得到鏡面的玻碳電極；

(4)+400mV條件下，將步驟(3)獲得的電極置于步驟(2)獲得的溶液中的時(shí)間為35～45s；

(5)以含有HCl與KCl的溶液為電解液，將步驟(4)獲得的電極進(jìn)行活化；

(6)將步驟(5)獲得的電極在100～110℃干燥55～65min并冷卻至室溫；

(7)將谷氨酸氧化酶與戊二醛溶液混合得到混合液，所述戊二醛溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～0.15％，所述谷氨酸氧化酶的含量為0.08～0.12U，所述混合液的體積為5μL，將混合液滴定于步驟(6)獲得的電極上。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法，其特征在于，所述步驟(1)中FeCl₃的含量為1.8～2.3mmol；所述K₃[Fe(CN) ₆]的含量為1.8～2.3mmol；所述HCl的含量為0.08～0.12mol；所述KCl的含量為0.08～0.12mol。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法，其特征在于，所述步驟(5)中HCl與KCl的濃度均為0.08～0.12mol/L；掃描速率為50mV/s；電壓為50mV～350mV；掃描次數(shù)為18～23次。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法，其特征在于，所述步驟(7)中谷氨酸氧化酶的制備方法包括下面步驟：

(1)谷氨酸氧化酶基因序列合成并構(gòu)建至質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；

(2)將質(zhì)粒與大腸感受態(tài)混勻，在冰上靜置30min后42℃熱激90s，再次冰上放置2min后加入到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后將培養(yǎng)后的菌液涂布于LB平板上過夜培養(yǎng)，從而得到谷氨酸氧化酶生產(chǎn)菌；

(3)將谷氨酸氧化酶生產(chǎn)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，再加入乳糖或異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體；

(4)用PBS緩沖液洗滌步驟(3)得到的菌體，離心，超聲破碎，收集上清液，即為谷氨酸氧化酶的粗酶液，純化粗酶液獲取谷氨酸氧化酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒為pET-28a；所述大腸感受態(tài)為大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法，其特征在于，所述粗酶液的純化方法包括：將粗酶液置于鎳柱中，通過50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L以及250mmol/L的咪唑溶液梯度洗脫，之后通過超濾管離心富集，得到純化后的谷氨酸氧化酶酶液。

7.一種根據(jù)權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述制備具有寬檢測(cè)線性范圍谷氨酸傳感電極的方法制備得到的谷氨酸傳感電極。