[發明專利]一種快速檢測潤楠葉枯病的引物、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 201910914666.0
• 申請日: 2019-09-26
• 公開（公告）號: CN110468233A
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 韓珊;汪昱伶;朱天輝;李姝江;譙天敏;王明;姜耀榮;衣建民;李硯鉞
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 51229 成都正華專利代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 肖芳<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明提供了一種快速檢測潤楠葉枯病的引物、試劑盒和檢測方法，所用引物序列為：F：5’?GAACTTACCATTGTTGCCTCG?3’，R：5’?CGCCGTTGTATTTCAGGAG?3’；快速檢測方法包括以下步驟：提取潤楠葉片DNA；以潤楠葉片DNA為模板采用上述引物進行巢式PCR反應；檢測擴增產物，當PCR產物呈現578bp的擴增條帶時，即表明葉片中含有致其葉枯的小孢擬盤多毛孢菌。方法可有效解決傳統的診斷方法存在的耗時、耗材和易錯過最佳防治時期的問題。

技術領域

本發明屬于植物疾病診斷技術領域，具體涉及一種快速檢測潤楠葉枯病的引物、試劑盒和檢測方法。

背景技術

潤楠(Machiluspingii)，樟科潤楠屬(Machilus)喬木，國家Ⅱ級重點保護野生植物，我國西南地區特有品種，主要分布于四川盆地西緣山地。其樹型高大挺直，木材紋理致密，是上等的用材樹種，為我國著名的珍貴用材和觀賞樹種之一，具有重要的經濟效益與生態效益。有研究表明，我國82種潤楠屬植物有71種處于瀕危狀態，因此當前各級政府大力支持發展潤楠等珍稀鄉土樹種人工林。

由小孢擬盤多毛孢(P.microspore)引起的潤楠葉枯病是目前危害潤楠的主要病害。受病原菌侵染后，植株出現葉梢枯黃、葉片早落等癥狀，重者葉片全部脫落、植株枯死。葉枯病對潤楠幼苗的栽培帶來極大困難，因此快速、準確地在發病初期對病菌的侵染動態進行檢測，采取及時有效的防治方法控制病害的發生對于減少經濟損失具有十分重要的意義。

傳統的林木真菌病害的診斷主要是在病原菌侵染林木并表現出一定的癥狀之后，通過癥狀觀察、組織分離的方法進行鑒定，但這一方法耗時、耗材且十分被動，易錯過最佳防治時期。

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種快速檢測潤楠葉枯病的引物、試劑盒和檢測方法，該方法可有效解決傳統的診斷方法存在的耗時、耗材和易錯過最佳防治時期的問題。

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種快速檢測潤楠葉枯病的引物，其序列為：F：5’-GAACTTACCATTGTTGCCTCG-3’，R：5’-CGCCGTTGTATTTCAGGAG-3’。

一種快速檢測潤楠葉枯病的方法，包括以下步驟：

(1)提取潤楠葉片DNA；

(2)以潤楠葉片DNA為模板，采用上述引物進行巢式PCR反應；

(3)檢測擴增產物，當PCR產物呈現578bp的擴增條帶時，即表明葉片中含有致其葉枯病的小孢擬盤多毛孢菌。

進一步地，步驟(2)中巢式PCR擴增體系25μL包括：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶22μL。

進一步地，步驟(2)中擴增程序：98℃預變性2min，98℃變性10s，63℃退火10s，72℃延伸20s，共34個循環，72℃延伸2min。

一種用于快速檢測潤楠葉枯病的試劑盒，包括：上述引物、潤楠葉片DNA提取試劑盒和TaqDNA聚合酶。

采取上述方案所產生的有益效果為：本發明采用特異性的引物以及巢式PCR技術可以有效快速的從健康的潤楠葉片中鑒定出早期感病的潤楠樹，并可以快速獲得鑒定結果，以便及時采取防治措施，無需等待犯病癥狀表達；而且，本法發明的檢測方法具有靈敏度高的優點。

附圖說明

圖1為P.microspore與其他菌DNA經常規PCR擴增后的電泳結果；

圖2為常規PCR靈敏度驗證電泳結果；

圖3為巢式PCR靈敏度驗證電泳結果；