[發(fā)明專利]熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)被毛孢的引物和探針

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910910688.X
• 申請(qǐng)日: 2019-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110484650A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊妙婷;楊濤;林冬梅;魏巍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都圖徑生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 51124 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所(普通合伙)
• 代理人: 黃鑫<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入國(guó)

本發(fā)明涉及熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)被毛孢的引物和探針，屬于熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)被毛孢Hirsutella sinensis的引物和探針，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，探針核苷酸序列的5’端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端結(jié)合有熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了中國(guó)被毛孢的檢測(cè)方法。該方法具有耗時(shí)短、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于冬蟲(chóng)夏草的人工培育和中國(guó)被毛孢菌野生資源的保護(hù)具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)被毛孢的引物和探針，屬于熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

冬蟲(chóng)夏草(Ophiocordyceps Sinensis)是一種十分名貴的藥用真菌，它是昆蟲(chóng)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)感染中國(guó)被毛孢(Hirsutalla sinensis)后，形成的蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的真菌感染復(fù)合體。受該真菌感染的蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，因感染后體內(nèi)長(zhǎng)滿該真菌而死亡，之后在特殊環(huán)境條件下，從蝙蝠蛾死后幼蟲(chóng)體上長(zhǎng)出的“草”是真菌中國(guó)被毛孢的子實(shí)體—子座。由于過(guò)度開(kāi)采和棲息地退化，冬蟲(chóng)夏草的自然生產(chǎn)非常有限，而且近年來(lái)年的產(chǎn)量一直在下降，因此它也被列為瀕危物種。

真菌中國(guó)被毛孢在分類學(xué)上屬子囊菌亞門(Ascomycotina)，核菌綱(Pyrenomycetes)，麥角菌目(Clavicipitales)，它是冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型，已被人工從冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)體上分離并廣泛培養(yǎng)。在冬蟲(chóng)夏草人工培養(yǎng)方面和野生資源保護(hù)兩方面，對(duì)中國(guó)被毛孢進(jìn)行檢測(cè)十分重要。目前，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是通過(guò)真菌培養(yǎng)和藥敏性實(shí)驗(yàn)，但存在耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)的缺陷，尤其是中國(guó)被毛孢具有生長(zhǎng)速度慢且分離困難的特點(diǎn)。此外，現(xiàn)有的檢測(cè)方法也無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的目的在于提供熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)被毛孢的引物和探針。本發(fā)明的另一目的在于提供中國(guó)被毛孢的檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供了熒光定量PCR檢測(cè)中國(guó)被毛孢Hirsutella sinensis的引物和探針，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探針的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，探針核苷酸序列的5’端結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端結(jié)合有熒光淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步地，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM。

進(jìn)一步地，所述的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。

本發(fā)明提供了所述的引物和探針在制備檢測(cè)中國(guó)被毛孢Hirsutella sinensis的試劑盒中的用途。

本發(fā)明提供了含有所述的引物和探針的試劑盒。

本發(fā)明提供了所述的試劑盒檢測(cè)中國(guó)被毛孢Hirsutella sinensis的用途。

本發(fā)明提供了中國(guó)被毛孢Hirsutella sinensis的檢測(cè)方法，包括如下步驟：取待測(cè)樣品，提取DNA，采用所述的引物和探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，將測(cè)得的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即得中國(guó)被毛孢含量。

進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系組成為：2X探針?lè)晒舛縬PCR Mix、模板DNA、所述的引物和探針以及水。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系每25ul的組成為：2X探針?lè)晒舛縬PCRMix12.5ul、模板DNA 5ul、上游引物0.5ul、下游引物0.5ul、探針0.5ul以及水6ul。

進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：50℃2min，然后95℃10min，接著95℃15s，最后60℃1min，40個(gè)循環(huán)。