[發明專利]基于light-up銀簇探針的熒光生物傳感器及其在miR-122檢測中的應用

在審

• 申請號: 201910889780.2
• 申請日: 2019-09-20
• 公開（公告）號: CN110564817A
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 王玉;張雪;劉素;黃加棟;宋曉蕾;李莎莎;王敬鋒;王海旺;孫文玉;王業茹
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 37218 濟南泉城專利商標事務所
• 代理人: 李桂存

本發明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于light?up銀簇探針的熒光生物傳感器及其制備方法，還涉及富G堿基增強銀納米簇方法。該發明的檢測方式是通過熒光信號的產生來進行miR?122的檢測，miR?122和其互補鏈的雜交引發三通路結構發生變化，暴露出toehold端，銀簇探針借助toehold端和GrHP發夾雜交，從而引發鏈置換反應，使得富G序列靠近銀簇部分，從而增強銀簇的熒光強度。該傳感器具有高效、高特異性、操作簡便、經濟、無標記的優點，并且體系中無需借助酶，可以彌補miR?122現有檢測方法的缺陷與不足，實現對其快速、準確的定量檢測及相關疾病的早期診斷。

技術領域

本發明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于light-up銀簇探針的熒光生物傳感器及其制備方法，還涉及富G堿基增強銀納米簇方法。

背景技術

MicroRNAs（MiRNAs）是一組非編碼的小RNA，在各種組織和器官中均有表達并且參與大部分生理過程。MiRNA的失調會導致一些疾病的發生，包括心血管疾病、帕金森病以及各種癌癥。在眾多的miRNA中，miR-122和肝臟疾病的發生密切相關，miR-122在正常人的肝臟中呈現高表達，但在肝癌患者的肝臟中表達量是下降的。此外，miR-122還和慢性C型肝炎病毒及藥物誘導的肝損傷有關。因此，miR-122的靈敏檢測對于研究肝病的發病機制和肝癌的早期診斷來說是非常重要的。

目前報道的miR-122檢測技術有電化學法、比色法、PCR、表面等離子體共振等，這些方法中有些存在操作復雜、成本高、信號不穩定、重現性差等問題。因此，目前需要構建一種操作簡單、高效、重現性好、可靠的技術用于miR-122的檢測。

發明內容

針對目前缺乏一種操作簡單、低成本的技術，本發明提供了一種基于三通路引發的toehold鏈置換反應及富G序列增強銀簇發光的熒光生物傳感器用于miR-122的檢測，本實驗主要是以DNA為模板合成銀納米簇用于產生熒光信號，并借助于toehold介導的鏈置換反應引起富G序列靠近銀簇熒光基團從而增強熒光強度來實現miR-122的檢測。本發明利用toehold介導的鏈置換反應可實現DNA鏈的快速遷移，顯著提高DNA雜交的速率，更有利于miR-122在實際樣本中的檢測。

本發明是通過以下步驟得到的：

基于light-up銀簇探針的熒光生物傳感器，包括以下原料：IS鏈、GrHP探針、BS鏈、銀簇、緩沖液、miR-122；

所述的GrHP堿基系列如SEQ No.1所示；

所述的IS堿基系列如SEQ No.2所示；

所述的BS堿基系列如SEQ No.3所示；

所述的AgNC-SP堿基系列如SEQ No.4所示；

所述的miR-122堿基系列如SEQ No.5所示。

上述熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）銀納米簇的制備；

（2）均相中銀納米簇和三通路結構發生鏈置換反應。

所述的步驟（1）的過程為：

將15μL，100μM AgNC-SP和4.5μL，2mM硝酸銀的混合溶液加入到76μL，20 mM，pH6.5磷酸鹽緩沖液中并于4℃反應15 min；之后，將4.5μL 2mM的硼氫化鈉加入到體系中，于暗處放置6小時以上，既得銀納米簇。

所述的步驟（2）的過程為：

將IS鏈、GrHP探針、鏈及步驟（1）的銀納米簇加入到緩沖液中在37℃下反應半小時使其形成三通路結構，之后將miR-122加入到三通路體系中反應；最后，向反應體系中加入超純水混合用熒光分光光度計進行檢測。