[發(fā)明專利]一種聚乙二醇修飾尿酸酶的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910875478.1
• 申請日: 2019-09-17
• 公開（公告）號(hào): CN112522225A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭新強(qiáng);馬魯南;劉忠
• 申請（專利權(quán)）人: 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/06
• 分類號(hào): C12N9/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明屬于生物技術(shù)及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇修飾尿酸酶的方法，包括如下步驟：將尿酸酶液溶解在碳酸鹽緩沖液中，加入PEG修飾劑及賴氨酸，4～30℃下攪拌反應(yīng)60～240min，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)超濾濃縮、分子篩純化即可得高純度聚乙二醇化尿酸酶。本發(fā)明在修飾過程中加入賴氨酸，有效提高了PEG修飾尿酸酶的均一度，并且降低了PEG修飾劑的用量，有效減少了PEG的降解。本發(fā)明聚乙二醇化尿酸酶的制備方法簡單、原料利用率高、酶活回收率高，處理量大，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇修飾尿酸酶的方法。

背景技術(shù)

尿酸酶又稱為尿酸氧化酶，他能催化尿酸氧化成尿囊素、二氧化碳和水。具有功能的尿酸酶存在于大部分生物體內(nèi)，但是隨著進(jìn)化靈長類體內(nèi)的基因突變導(dǎo)致尿酸氧化酶合成的功能丟失。因此，人體內(nèi)任何嘌呤分解代謝的增加或尿酸排泄的減少都會(huì)導(dǎo)致尿酸濃度的增加，血液中尿酸的濃度大于7mg/dl(女性6mg/dl)時(shí)會(huì)引起高尿酸血癥，高尿酸血癥進(jìn)一步發(fā)展就會(huì)導(dǎo)致尿酸在體內(nèi)關(guān)節(jié)處的積累，進(jìn)而形成痛風(fēng)。在高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療方法中，利用不同的方法重組的尿酸酶能夠快速有效降低患者血液中的尿酸，對于重度尿酸血癥患者、難治性痛風(fēng)患者以及腫瘤溶解綜合征患者均具有較好的療效。

但是由于尿酸酶的免疫原性比較大，并且在體內(nèi)的半衰期短，所以為了降低免疫原性和延長半衰期，可以對其化學(xué)修飾。常用的蛋白修飾劑為聚乙二醇(PEG)，PEG修飾是在體外將PEG共價(jià)連接在蛋白質(zhì)藥物上，以達(dá)到降低免疫原性和增加半衰期的效果。聚乙二醇是一種無毒、無免疫原性的水溶性高分子物質(zhì)，可以通過共價(jià)鍵結(jié)合方式修飾蛋白質(zhì)。經(jīng)PEG修飾后蛋白藥物的免疫原性降低，而且能夠提高蛋白的溶解性和穩(wěn)定性，減少腎臟的清除延長藥物的半衰期。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了多種PEG修飾重組蛋白藥物上市。例如CN1322141A公開的一種采用PEG修飾的是PEG飽和修飾重組豬和狒狒的尿酸酶。

對于PEG飽和修飾的尿酸酶，為了能夠做到飽和修飾需要加入過量的PEG。這就使得PEG的使用量很大，同時(shí)，由于反應(yīng)條件的問題，容易造成PEG降解嚴(yán)重。文獻(xiàn)International Journal of Pharmaceutics 387(2010)215–222中，尿酸酶的濃度為1mg/ml，PEG與尿酸酶摩爾比為370:1根據(jù)其電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在這個(gè)修飾條件下有部分尿酸酶沒有修飾，而且修飾均一度低，并且修飾度也低。專利CN 102634492A中，尿酸酶的蛋白濃度為4mg/ml，PEG與尿酸酶摩爾比為40:1～160:1，根據(jù)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果在試驗(yàn)范圍內(nèi)隨著PEG使用量的增大，修飾度增加，同時(shí)修飾均一度也有所增加，但是當(dāng)PEG加入量繼續(xù)增大，雖然俢飾度增加但是不能達(dá)到飽和修飾，也并不是隨著PEG使用量的增大，PEG修飾的均一度能進(jìn)一步有效的提高。因此，需要提供一種PEG用量小，修飾均一度高的PEG飽和修飾尿酸酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中PEG飽和修飾尿酸氧化酶過程中均一度差、PEG使用量大的缺陷，本發(fā)明提供一種聚乙二醇修飾尿酸酶的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種聚乙二醇修飾尿酸酶的方法，包括如下步驟：將尿酸酶液溶解在碳酸鹽緩沖液中，加入PEG修飾劑及賴氨酸，4～30℃下攪拌反應(yīng)60～240min，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)超濾濃縮、分子篩純化即可得高純度聚乙二醇化尿酸酶。

優(yōu)選地，所述尿酸酶液的濃度為3～8mg/ml，更加優(yōu)選為4～6mg/ml。

優(yōu)選地，所述碳酸鹽緩沖液為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液，其中鹽離子濃度為0.04～0.5mol/L，更加優(yōu)選為0.1～0.2mol/L。

優(yōu)選地，所述碳酸鹽緩沖液pH8.0～10.5，更加優(yōu)選為8.5～9.0。