[發明專利]血漿外泌體tRFs標志物及其在乳腺癌診斷中的應用

在審

• 申請號: 201910836250.1
• 申請日: 2019-09-05
• 公開（公告）號: CN110373471A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 黃健;張姝;鄭峻松;莫非;何蕓;陸景潤;劉敏;孫朝琴
• 申請（專利權）人: 貴州醫科大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明公開了一種血漿外泌體tRFs標志物及其在乳腺癌診斷中的應用，標志物是外泌體來源的tRF?Ser?AGA?018，其應用操作步驟：A.建立統一標準的標本庫和數據庫，以標準操作程序采集符合標準的血液樣本和組織樣本，系統收集完整的納入人群的臨床資料；B.血液中腫瘤源性外泌體來源的tRFs差異表達譜分析，選擇乳腺癌病例和健康人的血漿樣本，以及乳腺癌癌組織和癌旁組織，提取外泌體，進行tRFs和tiRNA測序，篩選出差異表達的tRFs；C.對已篩選的差異表達tRFs在大樣本人群中進行QRT?PCR定量分析。本發明血液中腫瘤源性外泌體的tRFs是一種新型生物標志物，穩定、微創、實時監測，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類非編碼RNA生物標志物的成功開發有助于乳腺癌診斷。

技術領域

本發明涉及乳腺癌診斷領域，特別是涉及一種血漿外泌體tRFs標志物及其在乳腺癌診斷中的應用。

背景技術

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，其發病率居我國女性惡性腫瘤之首，成為威脅女性健康的“頭號殺手”。早期乳腺癌不易發現，往往出現明顯病理癥狀才就診，盡管手術、放化療、內分泌治療以及生物治療等綜合治療使乳腺癌患者的長期生存率有所提高，但總生存率仍不理想。因此提高乳腺癌的診斷及療效監測水平是提高治療效果和延長生存時間的關鍵。理想的乳腺癌生物標志物應具有特異性高、敏感性高、無創性和實用性的特點，能夠對乳腺癌發生發展進行監測，同時減少創傷及患者的負擔。

目前，對乳腺癌的篩查和治療監控主要通過檢測血清學腫瘤標志物如糖類抗原CA153、CA50以及癌胚抗原(CEA)等，存在靈敏度性不高，特異性較差等問題。而循環腫瘤DNA(ctDNA)和循環腫瘤細胞(CTC)雖然大幅度提高靈敏度，但其含量受到血液及淋巴循環對其清除、降解等影響，存在檢出率低、來源復雜、特異性差等缺點，易出現假陽性。因此，發現新的高特異性、高敏感性的乳腺癌生物標志物，不僅為臨床抗癌靶向治療及預后判斷提供理論依據，還為降低有創檢查的頻率奠定基礎。

液體活檢是一種非侵入性的液體檢測，可以反復監測臨床腫瘤的技術，可從分子層面對腫瘤獲得更加廣泛的認識，可以提供癌癥病變所有的遺傳圖譜(包括原位癌和轉移癌)，同時可以為系統跟蹤基因進化提供機會。外泌體是一種直徑為30～160nm的胞外囊泡結構，是液體活檢技術中一項非常關鍵的研究材料，可以用于精準醫療。它是由細胞內多囊泡體(multivesicular body,MVB)與細胞膜融合后釋放到細胞外環境中的脂質雙分子膜包裹的小囊泡。外泌體被周圍腫瘤細胞或其他效應細胞攝取，能夠改變靶細胞狀態，參與腫瘤的發生發展。且腫瘤細胞與微環境之間能夠通過包裹遺傳物質和信號的外泌體進行細胞之間的“通訊”。與ctDNA、CTC相比，外泌體具有數量多、更易富集、外有被膜、所轉運的物質不易降解、在體內的傳遞信息具有廣泛性等優勢，是目前最為理想的液體活檢的分析材料。

外泌體攜帶豐富的生物學分子，特別是大量的遺傳物質，如DNA片段、mRNA、長鏈非編碼RNA(IncRNA)、小RNA(small RNA)等等。其中轉移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)衍生片段(tRNA-derived RNA fragment，tRF)，占外泌體所含核酸物質的15％，是豐度最高的小分子RNA之一。tRFs是在某些特定情況下，由成熟tRNA或前體tRNA被特異性剪切所產生。tRFs的重要性在近幾年才逐漸被發現，越來越多的證據顯示，其與InRNA的復雜調控機制、cfDNA繁復的突變位、mRNA的不穩定性相比，tRFs具有相對穩定不降解的特性，其具有類似mRNA功能，能夠影響調控基因的功能，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等生物學過程，同時還能結合蛋白質影響miRNA的穩定性

綜上所述，現有技術存在的問題是：

(1)血清學腫瘤標志物如糖類抗原CAl53、CA50以及癌胚抗原(CEA)等，存在靈敏度性不高，特異性較差等問題；