[發明專利]高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201910833893.0
• 申請日: 2019-09-04
• 公開（公告）號: CN110527656B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 劉龍;顧劉燕;劉克;堵國成;李江華;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 馮瑞

本發明公開了一種高效合成5?甲基吡嗪?2?羧酸的工程菌及其構建方法及應用，屬于生物工程技術領域。本發明的重組大腸桿菌是通過在大腸桿菌BL21(DE3)中組合優化二甲苯單加氧酶、苯甲醇脫氫酶和苯甲醛脫氫酶基因的表達，并強化表達二甲苯單加氧酶的電子轉移蛋白基因得到，通過改造獲得了高效合成5?甲基吡嗪?2?羧酸的大腸桿菌，其產量達到10.2g/L，且摩爾轉化率提高到67％。在底物濃度提高的同時，摩爾轉化率也有所提高。本發明重組大腸桿菌的構建方法簡單，便于使用，具有很好應用前景。

技術領域

本發明涉及一種高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其構建方法及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA)是用于合成格列吡嗪、阿昔莫司及5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等藥物的重要中間體以及作為金屬配合物用于制備催化劑。目前其合成主要采用化學合成法，可分為分子間環合法、吡嗪側鏈多步合成法、直接氧化法和電化學法。但化學合成法存在反應條件要求高，使用大量氧化劑，生產成本高，對環境污染較大的問題。生物轉化法則具有合成工藝簡單，底物選擇性好，催化效率高，雜質少，對環境污染小的優點，極具發展前景。

在惡臭假單胞桿菌中發現MPCA合成途徑，以2,5-二甲基吡嗪(2,5-Dimethylpyrazine)為起始底物，由二甲苯單加氧酶、苯甲醇脫氫酶、苯甲醛脫氫酶三步催化后，生成MPCA。其中二甲苯單加氧酶由xylM和xylA編碼，苯甲醇脫氫酶由xylB編碼，苯甲醛脫氫酶由xylC編碼。在惡臭假單胞菌中，二甲苯單加氧酶、苯甲醇脫氫酶、苯甲醛脫氫酶三個酶的表達需要使用甲苯或二甲苯先與xylR編碼的阻遏蛋白先結合，解除阻遏作用，從而激活基因前的Pu啟動子，繼而使上述的酶得以表達，所以需要在培養基中添加甲苯或二甲苯作為碳源及誘導劑。而甲苯和二甲苯均屬于致癌物，對人體及環境具有嚴重危害，同時其易燃且不易溶于水，對工業上生產5-甲基吡嗪-2-羧酸造成不便。

大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一種可用于高效表達含T7啟動子的表達載體的菌株，其遺傳背景清晰，分子手段多樣，是一種被廣泛用作異源表達重要化學品合成途徑的生產宿主。

專利CN201711325652中公開了一種采用大腸桿菌異源表達了來源于惡臭假單胞桿菌ATCC33015的二甲苯單加氧酶、苯甲醇脫氫酶、苯甲醛脫氫酶，但是該重組菌在提高底物濃度后，轉化率會下降，在底物濃度達到12g/L之后，摩爾轉化率下降至36％。而底物濃度低，雖然摩爾轉化率高，但會造成產量低，不利于工業化生產。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的重組大腸桿菌及其構建方法與應用，構建的重組大腸桿菌可以高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。

本發明的第一個目的是提供一種高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，所述的工程菌以大腸桿菌為宿主，重組表達了二甲苯單加氧酶、苯甲醇脫氫酶和苯甲醛脫氫酶，編碼所述的二甲苯單加氧酶、苯甲醇脫氫酶和苯甲醛脫氫酶的基因分別位于三個基因載體上。

進一步地，所述的二甲苯單加氧酶以pETDuet-1為基因載體，所述的苯甲醇脫氫酶以pCDFDuet-1為基因載體，所述的苯甲醛脫氫酶以pRSFDuet-1為基因載體。

進一步地，所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

進一步地，編碼所述的二甲苯單加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼所述的苯甲醇脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼所述的苯甲醛脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，所述的工程菌還強化表達了二甲苯單加氧酶的電子轉移蛋白基因。