[發明專利]一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術及應用

在審

• 申請號: 201910805561.1
• 申請日: 2019-08-28
• 公開（公告）號: CN110819728A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 胡守奎;閆琳琳;趙帆;牛莉娜;蔡煜;吳蕾;朱曉雪;高乃姝;農金輕;邢喆
• 申請（專利權）人: 北京大學首鋼醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 馬苗苗

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術及其在基因檢測中的應用，本發明提供的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，通過在多交叉置換擴增中的擴增引物C1的5’端標記標記物，所述方法針對鮑曼不動桿菌特異基因pgaD(標記異硫氰酸熒光素FITC)及其碳青霉烯耐藥基因blaOXA?23?like(標記異羥基洋地黃毒苷Dig)的擴增產物能被金納米生物傳感器可視化檢測，所述方法便捷、快速、敏感、特異，適宜于推廣應用于各種特異核苷酸片段的檢測，及應用于該特異核苷酸片段對應的病原菌的檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術及應用。

背景技術

核酸檢測，即核酸擴增檢測技術泛指以擴增DNA或RNA為手段，從而篩查特定基因的檢測技術，核酸擴增技術包括PCR擴增技術、恒溫擴增技術等，恒溫擴增技術相較PCR及其衍生技術而言，具有不依賴于熱循環擴增設備，整個擴增過程恒定在固定的溫度，反應速度快，敏感性強，特異性高等特點，有利于實現快速擴增，便捷檢測及現場診斷。目前，應用較為廣泛的恒溫擴增技術有滾環擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴的恒溫擴增(HDA)、環介導恒溫擴增(LAMP)及交叉擴增(CPA)等，檢測時存在不夠便捷、快速、敏感、特異的問題。

發明內容

鑒于上述問題，提出了本發明以便提供一種克服上述問題或者至少部分地解決上述問題的結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術及其在基因檢測中的應用。

本發明實施例中提供一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，包括：

自所述目標基因片段的3’端起，設定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目標基因片段的5’端起，設定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列 P1s的5’端設定第五任意序列C1，和/或，在所述第四任意序列P2的3’端設定第六任意序列C2s；

提供置換引物F1，所述引物F1含有與序列F1s互補的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有與序列C1互補的序列C1s和序列P1，提供置換引物F2，所述引物含有與序列F2s互補的序列，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有與序列C2互補的序列C2s和序列P2；

提供擴增引物，所述擴增引物包括含有序列C1的擴增引物C1，和/或，含有與序列C2s互補的擴增引物C2，在所述擴增引物C1的5’端標記標記物，獲得擴增引物C1*；

在Bst DNA聚合酶、鏈置換活性DNA聚合酶、引物存在下，使用所述目標基因片段作為模板恒溫擴增DNA，獲得標記MCDA目標基因片段；所述引物包括：置換引物F1和F2，交叉引物CP1和CP2，擴增引物D1、C1*、R1、D2、C2、R2；

以所述雙標MCDA基因片段作為檢測物，采用金納米檢測方法對所述檢測物進行檢測。

進一步的，所述標記物包括如下之一：異硫氰酸熒光素FITC、異羥基洋地黃毒苷Dig。

進一步的，所述MCDA反應中，所述反應溫度為恒溫，且溫度范圍為61-65℃。

進一步的，所述溫度為63℃。

進一步的，進行所述檢測時，依次將所述檢測物、檢測緩沖液滴加在所述檢測器具表面。

進一步的，所述檢測器具的組成部件包括：樣品墊、金標墊、纖維膜、吸水墊及背板，所述樣品墊、金標墊、纖維膜、吸水墊、背板按從上至下依次進行設置；所述金標墊中物質包括如下之一：金納米粒子偶聯的鏈霉素親和素SA-G、抗異硫氰酸熒光素抗體 anti-FITC、抗異羥基洋地黃毒苷抗體anti-Dig、生物素偶聯的牛血清蛋白B-BSA。