[發明專利]一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術及應用

在審

• 申請號: 201910805561.1
• 申請日: 2019-08-28
• 公開（公告）號: CN110819728A
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 胡守奎;閆琳琳;趙帆;牛莉娜;蔡煜;吳蕾;朱曉雪;高乃姝;農金輕;邢喆
• 申請（專利權）人: 北京大學首鋼醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 馬苗苗

1.一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，包括：

自所述目標基因片段的3’端起，設定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目標基因片段的5’端起，設定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端設定第五任意序列C1，和/或，在所述第四任意序列P2的3’端設定第六任意序列C2s；

提供置換引物F1，所述引物F1含有與序列F1s互補的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有與序列C1互補的序列C1s和序列P1，提供置換引物F2，所述引物含有與序列F2s互補的序列，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有與序列C2互補的序列C2s和序列P2；

提供擴增引物，所述擴增引物包括含有序列C1的擴增引物C1，和/或，含有與序列C2s互補的擴增引物C2，在所述擴增引物C1的5’端標記標記物，獲得擴增引物C1*；

在Bst DNA聚合酶、鏈置換活性DNA聚合酶、引物存在下，使用所述目標基因片段作為模板恒溫擴增DNA，獲得標記MCDA目標基因片段；所述引物包括：置換引物F1和F2，交叉引物CP1和CP2，擴增引物D1、C1*、R1、D2、C2、R2；

以所述雙標MCDA基因片段作為檢測物，采用金納米檢測方法對所述檢測物進行檢測。

2.根據權利要求1所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，其特征在于，所述標記物包括如下之一：異硫氰酸熒光素FITC、異羥基洋地黃毒苷Dig。

3.根據權利要求1所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，其特征在于，所述MCDA反應中，所述反應溫度為恒溫，且溫度范圍為61-65℃。

4.根據權利要求3所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，其特征在于，所述溫度為63℃。

5.根據權利要求1所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，其特征在于，進行所述檢測時，依次將所述檢測物、檢測緩沖液滴加在所述檢測器具表面。

6.根據權利要求5所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，其特征在于，所述檢測物與所述檢測緩沖液用量體積比為1∶600。

7.根據權利要求5所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術，其特征在于，所述檢測器具的組成部件包括：樣品墊、金標墊、纖維膜、吸水墊及背板，所述樣品墊、金標墊、纖維膜、吸水墊、背板按從上至下依次進行設置；所述金標墊中物質包括如下之一：金納米粒子偶聯的鏈霉素親和素SA-G、抗異硫氰酸熒光素抗體anti-FITC、抗異羥基洋地黃毒苷抗體anti-Dig、生物素偶聯的牛血清蛋白B-BSA。

8.一種如權利要求1-7任一項所述的結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術的應用，其特征在于，用于檢測鮑曼不動桿菌特異基因pgaD和鮑曼不動桿菌的碳青霉烯耐藥基因blaOXA-23-like。

9.根據權利要求8所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術的應用，其特征在于，

用于檢測所述pgaD時，標記物為所述FITC，金標墊中物質包括如下之一：所述SA-G、所述B-BSA、所述anti-FITC；

用于檢測所述blaOXA-23-Iike時，標記物為所述Dig，金標墊中物質包括如下之一：所述SA-G、所述B-BSA、所述anti-Dig。

10.根據權利要求8所述的一種結合多交叉置換擴增和金納米檢測的檢測技術的應用，其特征在于，

用于檢測所述pgaD時，引物選自下列序列組合：

如SEQ ID NO：1所示的置換引物F1，如SEQ ID NO：2所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：3所示的擴增引物C1*，如SEQ ID NO：4所示的擴增引物D1，如SEQ ID NO：5所示的擴增引物R1，如SEQ ID NO：6所示的擴增引物R2，如SEQ ID NO：7所示的擴增引物D2，如SEQ ID NO：8所示的擴增引物C2，如SEQ ID NO：9所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：10所示的置換引物F2；

用于檢測所述blaOXA-23-like時，引物選自下列序列組合：

如SEQ ID NO：11所示的置換引物F1，如SEQ ID NO：12所示的交叉引物CP1，如SEQ IDNO：13所示的擴增引物C1*，如SEQ ID NO：14所示的擴增引物D1，如SEQ ID NO：15所示的擴增引物R1，如SEQ ID NO：16所示的擴增引物R2，如SEQ ID NO：17所示的擴增引物D2，如SEQID NO：18所示的擴增引物C2，如SEQ ID NO：19所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：20所示的置換引物F2。