[發(fā)明專利]一種基于雙細(xì)胞水平的皮膚光刺激性評(píng)價(jià)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910799521.0
• 申請(qǐng)日: 2019-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN110628866A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃健聰;程樹軍;馮鑒鴻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 44104 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 周克佑;劉艷麗

本發(fā)明公開了一種基于雙細(xì)胞水平的皮膚光刺激性評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：(1)獲取離體正常人皮膚角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞鋪板；(2)取細(xì)胞鋪板，去除上部培養(yǎng)液，分別加入一系列不同濃度的受試物，置于UV下進(jìn)行輻照，記為UV+，在暗處放置相同時(shí)間，記為UV?；(3)暴露結(jié)束后，測試受試物在不同濃度下的細(xì)胞活性，計(jì)算IC₅₀值，獲取角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞IC₅₀值(UV+)和IC₅₀值(UV?)；(4)計(jì)算光刺激比值，根據(jù)該比值，將受試物分為非皮膚光刺激物、可疑皮膚光刺激物和皮膚光刺激物。該法具有快速、通量高、可重復(fù)性良好、與人相關(guān)性高等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)多種受試物進(jìn)行快速評(píng)價(jià)，大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于非動(dòng)物測試方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于雙細(xì)胞水平的皮膚光刺激性評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)

某些化合物，稱為光感物質(zhì)，在光照(主要是紫外線)的作用下由穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞組織產(chǎn)生有害作用。皮膚覆蓋于人體表面，是人體與外界環(huán)境最外的屏障。而皮膚作為與紫外線直接接觸的器官，皮膚表面涂抹的藥物、化妝品等，可引起光刺激性，通常表現(xiàn)為受到照射的部位皮膚瘙癢、疼痛、紅腫，出現(xiàn)鮮紅色丘疹和水皰，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致皮膚組織壞死等損傷。

日常接觸的化學(xué)物質(zhì)中，瀝青、煤焦油、燃料等，化妝品香料中佛手柑精油、檸檬油、檀香油等，植物中的檸檬、莧菜、香菜等，中藥中的補(bǔ)骨脂、白芷、防風(fēng)等，還有藥物類的磺胺、氯丙嗪、水楊酸鹽類及口服避孕藥中的雌激素等都是光感物質(zhì)，都可以引起皮膚甚至全身光反應(yīng)性。

現(xiàn)有的皮膚光毒性評(píng)價(jià)方法為豚鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在豚鼠皮膚涂抹受試物后進(jìn)行光照，觀察輻照后皮膚的紅斑水腫進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)測。但是其主觀性/重復(fù)性差、物種差異、周期長、成本高、通量低、使用活體動(dòng)物造成動(dòng)物痛苦死亡等不足，已經(jīng)逐步被現(xiàn)代毒理學(xué)所淘汰。目前，以體外技術(shù)為核心的試驗(yàn)方法，逐漸被許多國家和地區(qū)的監(jiān)管部門所接受和認(rèn)可。基于細(xì)胞水平的3T3光毒性試驗(yàn)，為多方監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受，并廣泛應(yīng)用于光毒性評(píng)價(jià)，但是其具由較高的假陽性率，采用小鼠來源的細(xì)胞，且并不特異性針對(duì)皮膚局部光刺激性，仍具有一定的局限性。目前仍未有公認(rèn)的專門用于皮膚光刺激性的體外測試方法。

人體皮膚主要由表皮角質(zhì)層和真皮成纖維細(xì)胞組成，研究指出，UVA輻照可達(dá)真皮層，其主要作用于角質(zhì)層和真皮層，而UVB主要作用于表皮層，并未達(dá)到真皮層。且離體皮膚分離角質(zhì)細(xì)胞和成纖維可以在體外培養(yǎng)并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)功能，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類皮膚相關(guān)的安全和功效評(píng)價(jià)中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種基于雙細(xì)胞水平的皮膚光刺激性評(píng)價(jià)方法，該方法通過兩種皮膚相關(guān)細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，分析在有無紫外輻照下，通過測量細(xì)胞存活的情況，評(píng)價(jià)待測物質(zhì)是否具有皮膚光刺激性，具有快速、簡便、通量高、與人相關(guān)性高等特點(diǎn)，可以對(duì)多種受試物進(jìn)行快速評(píng)價(jià)，大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。

本發(fā)明的上述目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種基于雙細(xì)胞水平的皮膚光刺激性評(píng)價(jià)方法，包括以下步驟：

(1)獲取離體正常人皮膚角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，采用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)和鑒定后分別進(jìn)行細(xì)胞鋪板；

(2)取步驟(1)中細(xì)胞鋪板，去除上部培養(yǎng)液，保留底部的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，分別加入一系列不同濃度的受試物，預(yù)處理后置于UV下進(jìn)行輻照，記為UV+，在暗處放置相同時(shí)間，記為UV-；

(3)暴露結(jié)束后進(jìn)行重新培養(yǎng)，然后測試受試物在不同濃度下的細(xì)胞活性，計(jì)算IC₅₀值，即引起一半細(xì)胞抑制的濃度，獲取角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞IC₅₀值(UV+)和IC₅₀值(UV-)；

(4)計(jì)算光刺激比值RPV＝IC₅₀(UV-)/IC₅₀(UV+)，根據(jù)該比值，將受試物區(qū)分為非皮膚光刺激物、可疑皮膚光刺激物和皮膚光刺激物，具體如下：