[發明專利]一種基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法

在審

• 申請號: 201910799521.0
• 申請日: 2019-08-27
• 公開（公告）號: CN110628866A
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 黃健聰;程樹軍;馮鑒鴻
• 申請（專利權）人: 廣州市華代生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 44104 廣州知友專利商標代理有限公司
• 代理人: 周克佑;劉艷麗

1.一種基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是包括以下步驟：

(1)獲取離體正常人皮膚角質細胞和成纖維細胞，采用常規培養液培養和鑒定后分別進行細胞鋪板；

(2)取步驟(1)中細胞鋪板，去除上部培養液，保留底部的角質細胞和成纖維細胞，分別加入一系列不同濃度的受試物，預處理后置于UV下進行輻照，記為UV+，在暗處放置相同時間，記為UV-；

(3)暴露結束后進行重新培養，然后測試受試物在不同濃度下的細胞活性，計算IC₅₀值，即引起一半細胞抑制的濃度，獲取角質細胞和成纖維細胞IC₅₀值(UV+)和IC₅₀值(UV-)；

(4)計算光刺激比值RPV＝IC₅₀(UV-)/IC₅₀(UV+)，根據該比值，將受試物區分為非皮膚光刺激物、可疑皮膚光刺激物和皮膚光刺激物，具體如下：

2.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(1)中所述離體正常人皮膚角質細胞和成纖維細胞來源于手術分離的皮膚組織。

3.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(1)中細胞鋪板時：將角質細胞細胞和成纖維細胞分別以(0.5-2)×10⁵個/mL的密度接種于96孔板中，培養箱培養過夜18-22h，培養條件37±0.5℃，(5±1)％CO₂濃度，飽和濕度，每種細胞制備相同的兩塊96孔板。

4.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(2)中所述的受試物包括化學物質、表面活性劑、化妝品香料、植物、植物提取物、中藥、中藥提取物和西藥中的一種或幾種。

5.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(2)中所述一系列不同濃度的受試物為梯度設置，每種受試物設置6-12個濃度。

6.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(2)中所述一系列不同濃度的受試物采用緩沖液稀釋獲得，所述緩沖液為Hank's平衡鹽溶液(HBSS)、含鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(DPBS)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。

7.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(2)中所述預處理為返回培養箱中繼續培養0.5-6h。

8.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(2)中置于UV下進行輻照時，成纖維細胞輻照劑量為UVA 2-12J/cm²；角質細胞輻照劑量為UVA 2-12J/cm²或UVB100-1000mJ/cm²。

9.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(3)中重新培養時，先清洗細胞層1～3次，再重新加入培養液，培養箱中培養20±2h，然后測量受試物不同濃度下細胞活性。

10.根據權利要求1所述的基于雙細胞水平的皮膚光刺激性評價方法，其特征是：步驟(3)中測量受試物在不同濃度下的細胞活性時，采用MTT、XTT、中性紅或CCK-8方法，計算不同濃度下相對細胞活性。