[發明專利]一種金黃色葡萄球菌腸毒素B納米抗體B1、應用及試劑盒

在審

• 申請號: 201910764200.7
• 申請日: 2019-08-19
• 公開（公告）號: CN110563839A
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 王建龍;季艷偉;王妍入;李想;路云龍;張敢為;陳利莉
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N15/13;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 61216 西安恒泰知識產權代理事務所
• 代理人: 王孝明

本發明公開了一種金黃色葡萄球菌腸毒素B納米抗體B1、應用及試劑盒。本發明獲得的納米抗體具有相對分子質量小、穩定性強、產量高、能特異性識別SEB，較常規單克隆抗體用途更廣，特異性更強。本發明公布了這種納米抗體及編碼該納米抗體的基因序列，生產該納米抗體的方法以及應用了該抗體的試劑盒。本發明獲得的納米抗體可避免與金黃色葡萄球菌表面蛋白A結合，表現出較高特異性，具有穩定性好、分子量小且可大規模生產。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素B納米抗體B1、應用及試劑。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一種常見的食源性致病菌，由其引起的食品中毒在革蘭氏陽性菌中高居首位，其致病能力主要取決于該菌產生的腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)。SEs是由金黃色葡萄球菌分泌產生的可溶性胞外毒素蛋白質，結構相似，分子量為27.5～30kDa，熱穩定性好，經100℃煮沸30min而不被破壞，因此，金黃色葡萄球菌污染的食物經過一般加熱處理后，雖然細菌菌體可被殺死，但其產生的腸毒素仍然具有活性和致病力。按血清學分類，主要有A、B、Cs、D、E等血清型，其中SEB是SEs家族里毒力最強，對熱最穩定，主要存在于肉類，乳等蛋白質含量較高的動物性食品中。當SEB攝入量達到20～100ng時就會使易感人群出現惡心，嘔吐，腹痛和腹瀉等中毒癥狀，因此，對食品中SEB的檢測顯得尤為重要。然而，SEB的檢測存在兩個主要問題：首先食物基質的成分較為復雜，含有多種蛋白質、脂類及其他化合物，這些成分的存在給SEB的準確檢測造成了干擾；其次，SA在食物中往往僅產生痕量或微量的SEB(ng/g)這對檢測方法的靈敏度提出了較高的要求。在食物基質中實現對腸毒素的定量檢測一直是一項具有挑戰性的任務。目前，免疫學檢測方法因具有快速、特異性強、操作簡便、結果易于判斷等特點被廣泛應用于SEs的快速檢測中。其中免疫學檢測法因具有操作簡單、檢測速度快等特點，是SEs例行篩查檢測中最常用方法且發展較為成熟的檢測方法，其原理為兩個識別SEB表面的兩個抗原位點的抗體，在SEB存在時形成夾心結構，借助檢測抗體上的標記物從而判讀檢測結果。目前，國內外研究制備的金黃色葡萄球菌及其腸毒素抗體均為識別其表面抗原的多克隆抗體或單克隆抗體，但是傳統單克隆抗體的制備耗時耗力且產量低，且葡萄球菌蛋白A(spA)的干擾是對SEs的基于免疫學檢測中最重要的問題。SpA是金黃色葡萄球菌在細胞表面展示的蛋白質，也在外部釋放，強烈結合哺乳動物產生的所有IgG的Fc端，因此，用于檢測金黃色葡萄球菌毒素的抗體會產生假陽性結果，使方法準確性較差，從而影響了應用價值。

納米抗體技術，是在傳統抗體的基礎上，運用分子生物學技術研發得到，是目前已知最小的可結合抗原的抗體分子。最初有比利時科學家Hamers.R在駱駝血液中發現，普通的抗體蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，而從駱駝血液中發現的新型抗體天然缺失輕鏈和重鏈恒定區1(CH1)的重鏈抗體，克隆其可變區得到只由一個重鏈可變區組成的單域抗體，稱為單域重鏈抗體(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，又稱為納米抗體(nanobody，Nb)。納米抗體與多克隆抗體和單克隆抗體相比，還具有以下優點：

1)無Fc識別位點，可避免與protein A結合導致的假陽性問題；

2)具有更長的CDR3區，且CDRs區和自身的另一些結構域不存在成對互補關系，故具有更多的柔韌性和凸面性，加之小體積(12～15kD，2×2×4nm)，能其更好的和抗原表面的裂縫和腔隙相結合，從而提高納米抗體的抗原特異性和親和力，在納摩爾至皮摩爾范圍內都有很好的親和力。在相同的檢測范圍內，單價納米抗體的親和力是普通二價抗體的兩倍。特別對于表面結構較復雜的細菌或大分子蛋白等，納米抗體將有利于克服表面結構的位阻效應與表面抗原識別。

3)納米抗體穩定性高、水溶性好、可在微生物系統中大量合成表達，為納米抗體低成本、高效率的生產創造了條件。