[發(fā)明專利]一種定量檢測腦組織中Aβ40蛋白的方法

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• 申請日: 2017-09-08
• 公開（公告）號: CN107765015A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李嬌;馮流星;羅施中;韓亞琛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量科學(xué)研究院;北京化工大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N27/62
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11614
• 代理人: 高爽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種定量檢測腦組織中Aβ₄₀蛋白的方法。

背景技術(shù)

Aβ淀粉樣蛋白(Aβ)由第21號染色體編碼，是淀粉樣蛋白前體(APP)經(jīng)蛋白水解酶作用后的底物，是阿爾茨海默病腦內(nèi)主要病理標(biāo)志性蛋白之一，它的形成、沉積和降解啟動和貫穿了AD的整個病理過程。Aβ₄₂是由42個氨基酸組成的蛋白質(zhì)片斷(其氨基酸序列為DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，如SEQ ID NO：1所示)，若在其纈氨酸711和異亮氨酸712之間酶切割則形成Aβ₄₀(其序列為DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV，如SEQ ID NO：2所示)。Aβ₄₀是由40個氨基酸組成的蛋白片斷，正常老年人和AD患者腦內(nèi)均存在，并且AD患者腦中含量多于正常患者。

Aβ蛋白在腦中含量很少、容易聚集并且腦中基體復(fù)雜，這些都為Aβ在腦中的絕對定量造成了困難。現(xiàn)在常用的定量方法是ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒法，酶免疫試驗還是有其局限性的，不但所檢測的生物學(xué)體液樣本如組織勻漿液中有可能存在各種干擾實驗的因素，而且在實驗過程中，影響結(jié)果的因素也很多，尤其是進(jìn)行手工ELISA測定時。

因此，亟待一種能準(zhǔn)確絕對定量腦組織中的Aβ₄₀蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能準(zhǔn)確絕對定量腦組織中Aβ₄₀蛋白的方法。

免疫沉淀法(Immunoprecipitation，IP)是一種研究蛋白質(zhì)間交互作用的生物技術(shù)，這種技術(shù)是將蛋白質(zhì)視為抗原，并利用磁珠上的抗體與之進(jìn)行特異性結(jié)合的特性，來進(jìn)行研究。這項技術(shù)可用來將含有上千種不同蛋白質(zhì)的樣品中，分離和濃縮出特定蛋白質(zhì)。目前常用的IP后目標(biāo)蛋白鑒定的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western Blot、質(zhì)譜鑒定等。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無論是在理論上還是在設(shè)計上都十分簡單和高效。

本發(fā)明建立了一種聯(lián)用免疫沉淀與基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜的方法，命名為IP-MALDI-TOF技術(shù)，檢測腦組織中Aβ₄₀蛋白，并在進(jìn)MALDI-TOF之前就加入一種內(nèi)標(biāo)物，以此來準(zhǔn)確絕對定量腦組織中的Aβ₄₀蛋白。

具體地，本發(fā)明提供一種定量檢測腦組織中Aβ₄₀蛋白的方法，該方法通過聯(lián)用免疫沉淀與基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜，實現(xiàn)腦組織中Aβ₄₀蛋白的定量檢測。

更具體地，該方法包括以下步驟：

(1)將含有Aβ₄₀蛋白的待測樣品與偶聯(lián)有Aβ₄₀蛋白抗體的磁珠混合，通過免疫沉淀把目標(biāo)Aβ₄₀蛋白富集到磁珠上，形成磁珠-抗體-蛋白復(fù)合物；

(2)用洗脫液洗脫，將Aβ₄₀蛋白從磁珠-抗體-蛋白的復(fù)合物中分離出來，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜檢測。

免疫沉淀實驗的操作步驟比較多，同時由于在非變性條件下進(jìn)行實驗，所以要得到一個完美的實驗結(jié)果，不僅需要高質(zhì)量的抗體，同時對免疫沉淀體系也需要有嚴(yán)格的控制指標(biāo)。免疫沉淀實驗從蛋白樣品前處理、抗體-磁珠的孵育、抗體-磁珠復(fù)合物洗脫到最后的鑒定，每步都非常關(guān)鍵，需要嚴(yán)格控制實驗流程中每個關(guān)鍵步驟的質(zhì)量，才能最終達(dá)到實驗?zāi)康摹?/p>

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述Aβ₄₀蛋白抗體包括Biolegend公司的三種抗Aβ₄₀蛋白抗體：M2.3、4G8、11A50-B10。利用這三種抗體同時連接到磁珠上按上述方法富集Aβ₄₀標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過MALDI-TOF檢測，回收率達(dá)到48.7％。

根據(jù)本發(fā)明，所述洗脫液為酸性洗脫液，包括但不限于鹽酸。所述洗脫液的pH值優(yōu)選為1.0-3.0。

優(yōu)選地，基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜測定中，以α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)。