[發明專利]生物發酵降解制備靈芝活性多糖及其分析方法

在審

• 申請號: 201910735939.5
• 申請日: 2019-08-09
• 公開（公告）號: CN110396531A
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 劉艷芳;唐慶九;馮杰;高坤;張勁松;楊焱;顏夢秋;周帥;李德順;張忠
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;C12Q1/42;C12R1/645
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張雪

本發明公開了生物發酵降解制備靈芝活性多糖及其分析方法，包括以下步驟：S1：靈芝液體發酵培養：先將靈芝菌株轉接至平板PDA培養基中，在25?30℃培養箱中培養5?7d進行活化，待菌絲體長滿平板之后，挑取3?6mm²大小的菌塊接入裝液量為100mL的250mL搖瓶中進行液體發酵培養7?10d得一級種；按照10％的接種量接入液體培養基中；酵母菌發酵法生物降解靈芝大分子多糖的方法，結合乙醇沉淀獲得制備活性低分子量多糖組分的方法，添加的酵母將胞外液中的大分子量的多糖降解為分子量較低的多糖。并確定了靈芝活性多糖組分通過與Dectin?1受體結合激活NF?κB途徑來增強機體免疫活性的用途。

技術領域

本發明涉及到生物工程的領域，特別涉及生物發酵降解制備靈芝活性多糖及其分析方法。

背景技術

靈芝(Ganoderma spp.)是我國著名的藥用真菌，具有廣泛的藥理作用和極低的毒性，臨床上可用于輔助治療各種疾病，包括腫瘤、支氣管炎癥、神經衰弱等。現代藥理學研究已經證明靈芝的藥用價值主要包括調節免疫、抗腫瘤、抗輻射以及輔助治療心血管疾病等。靈芝已經逐漸成為保健類功能食品和中藥產品研發領域的重要資源。

靈芝中的化學成分非常復雜，現在已經分離出的成分達數十種之多，多糖是靈芝最主要的活性成分之一，在抗腫瘤、調節機體免疫等方面效果顯著。前期研究表明，靈芝子實體和發酵胞外液中均主要包含分子量為百萬級的大分子多糖組分和分子量為1萬-10萬級的低分子量多糖組分。大分子量多糖組分具有易于分離且活性較好的特點，但由于其分子量大、粘度大且難溶于水，使其進一步開發應用受到極大限制。傳統方法采用酸堿水解及超聲波、微波破碎等來降低多糖的相對分子質量，以提高其水溶性，增強多糖的生物活性，但由于效果不佳及產物安全性問題而難以推廣。近年來生物酶法降解日益受到重視，但多糖是一類分子結構緊密的大分子物質，在分子內部很難進行酶解反應，效率較低。因此選擇合適的降解方法是開發利用靈芝多糖的關鍵。

酵母菌是一種天然的發酵劑，有一套自身的胞內和胞外酶系統，用以維持有機體正常的生長和代謝活動。有研究發現：中藥在經過酵母菌發酵之后，有效成分的含量以及藥效得到了明顯的提升，并且生成了新的化合物。

發明內容

本發明的目的在于提供生物發酵降解制備靈芝活性多糖及其分析方法，發酵所得各多糖組分均具有顯著的活性，并確定了靈芝活性多糖組分通過與Dectin-1受體結合激活NF-κB途徑來增強機體免疫活性的用途，為其后續的開發利用提供基礎。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：生物發酵降解制備靈芝活性多糖，包括以下步驟：

S1：靈芝液體發酵培養：先將靈芝菌株轉接至平板PDA培養基中，在25-30℃培養箱中培養5-7d進行活化，待菌絲體長滿平板之后，挑取3-6mm²大小的菌塊接入裝液量為100mL的250mL搖瓶中進行液體發酵培養7-10d得一級種；按照10％的接種量接入液體培養基中，培養7-10d后得二級種子液，再按照10％的接種量接入發酵培養基中，然后放入搖床內，轉速控制在100-200rpm/min，溫度為25-30℃，培養7-10d，結束發酵；

S2：靈芝發酵胞外液的分離：待發酵培養結束后，收集發酵液在6000-8000r/min轉速條件下離心，取上清液進行高壓滅菌處理；

S3：酵母菌發酵降解：將酵母在平板培養基上進行活化，于26℃培養3d左右，待長滿平板之后，挑取4mm²大小的菌塊接入250mL搖瓶液體培養基，于150r/min，26℃的搖床上培養3d，按照10％的接種量接入上述滅過菌的靈芝胞外液中培養至24h、72h和120h取樣，6000-8000r/min轉速條件下離心分離酵母菌與胞外液；