[發(fā)明專利]CRISPR/Sa-SeqCas9基因編輯系統(tǒng)及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910731390.2
• 申請日: 2019-08-08
• 公開（公告）號: CN110551760B
• 公開（公告）日: 2022-11-18
• 發(fā)明（設計）人: 王永明;胡子英;王大奇;王帥
• 申請（專利權(quán)）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/864;C12N15/10;C12N9/22;C12N15/113
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1. 一種CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，基因編輯為在細胞中或體外進行基因編輯，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)為Sa-SeqCas9蛋白和sgRNA復合體，能精確定位靶向DNA序列，并產(chǎn)生切割，使DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷；所述Sa-SeqCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述細胞包括真核細胞和原核細胞；所述真核生物細胞包括哺乳動物細胞和植物細胞；所述哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢細胞、幼倉鼠腎細胞、小鼠Sertoli 細胞、小鼠乳腺瘤細胞、buffalo 大鼠肝細胞、大鼠肝瘤細胞、由SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎CVI 系、猴腎細胞、犬腎細胞、人宮頸癌細胞、人肺細胞、人肝細胞、HIH/3T3 細胞、人U2-OS 骨肉瘤細胞、人A549 細胞、人K562 細胞、人HEK293 細胞、人HEK293T 細胞、人HCT116 細胞或人MCF-7 細胞或TRI 細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述Sa-SeqCas9蛋白包括無切割活性或僅具有單鏈切割活性或具有雙鏈切割活性的Sa-SeqCas9蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述精確定位DNA序列包括sgRNA中的5’端20bp或21bp序列與靶向DNA序列能形成堿基互補配對結(jié)構(gòu)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述精確定位靶向DNA序列包括Sa-SeqCas9蛋白和sgRNA復合體識別靶向DNA序列上的PAM序列。

6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述PAM序列為NNGRM，所述靶向DNA序列為SEQ ID NO3所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述sgRNA可以進行磷酸化、縮短、加長、硫化、甲基化或羥基化修飾。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述Sa-SeqCas9蛋白和sgRNA復合體能精確靶向DNA序列指Sa-SeqCas9蛋白和sgRNA復合體可以識別并結(jié)合特定DNA序列，或指將與Sa-SeqCas9蛋白融合的其他蛋白或特異性識別sgRNA的蛋白帶至靶向DNA的位置。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述Sa-SeqCas9蛋白和sgRNA復合體或與Sa-SeqCas9蛋白融合的其他蛋白或特異性識別sgRNA的蛋白可以對靶向DNA區(qū)域進行修飾和調(diào)控，所述修飾和調(diào)控包括基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、DNA甲基化調(diào)控、DNA乙酰化修飾、組蛋白乙酰化修飾、單堿基轉(zhuǎn)換器或染色質(zhì)成像追蹤。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述單堿基轉(zhuǎn)換器包括堿基腺嘌呤到鳥嘌呤、胞嘧啶到胸腺嘧啶、胞嘧啶到尿嘧啶或其它堿基之間的轉(zhuǎn)換。