[發明專利]煙曲霉單寧酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 201910724490.2
• 申請日: 2019-08-07
• 公開（公告）號: CN110499302A
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發明（設計）人: 盧海強;谷新晰;陳偉;陳寶江;谷子林
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/81;C12N1/19;C12N15/11;A23L2/84;C12R1/68;C12R1/84
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• 代理人: 葉立濤<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了一種煙曲霉單寧酶突變體。所述突變位點為Kex2蛋白酶切割位點K315?R316。本發明通過對單寧酶AfTanA中Kex2蛋白酶位點K315?R316對酶性質的影響分析，明確該位點對于酶的催化效率和穩定性影響較大，雙點的缺失突變AfTanΔKR單寧酶表現出更加優良的酶學特性，具有在食品工業中發揮巨大作用的潛力。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種煙曲霉單寧酶突變體及其在柿子汁加工中的應用。

背景技術

單寧酶(Tannase EC 3.1.1.20)是可將單寧中的酯鍵與縮酚羧鍵斷裂，生成葡萄糖和沒食子酸等物質的一類酶的總稱，在速溶茶、葡萄酒和啤酒等食品加工領域具有巨大的應用潛力。盡管人們對單寧酶的研究具有廣泛興趣和較長的歷史，到目前為止，人們對單寧酶的研究主要集中在產酶微生物的篩選及產酶特性分析方面，僅有數個單寧酶基因被克隆并表達，涉及的微生物有米曲霉，黑曲霉、植物乳桿菌等。畢赤酵母作為優良的表達宿主，上百種酶基因已經在畢赤酵母中進行了高效表達。單寧酶基因富含二硫鍵、且以多聚體和高子量等特征，這使得單寧酶基因個克隆和表達具有較強的復雜性，探究影響單寧酶在畢赤酵母中因素意義重大。

發明人所在課題組前期從從濃香大曲中篩選獲得產單寧酶嗜熱真菌(A.fumigatus HBHF5)，該菌類種屬條件致病菌，具有一定潛在的安全風險。為此，將該菌株中的單寧酶基因(afTanA)在P.pastoris GS115中進行了高效表達。檢測發現畢赤酵母表達的重組單寧酶(AfTanA)由2個30kD左右大小亞基組成，且酶的穩定性降低，推測這些性質的改變與Kex2蛋白酶作用相關。單寧酶中普遍含有1-2個Kex2位點，AfTanA單寧酶中Kex2位點對酶學特性影響還不清楚。因此，亟待深入開展Kex2位點對單寧酶AfTanA性質影響的研究工作。

發明內容

本發明的目的在于提供一種煙曲霉單寧酶突變體，探討Kex2蛋白酶酶切位點對該酶的pH穩定性、耐熱穩定性及在柿子汁加工應用效果的影響，為單寧酶的生產及性能改造提供理論指導。

一種煙曲霉單寧酶突變體，所述突變位點為Kex2蛋白酶切割位點K315-R316。

含上述煙曲霉單寧酶突變體的基因的載體。

含上述煙曲霉單寧酶突變體基因載體的工程菌。

擴增上述的煙曲霉單寧酶突變體的基因中任一片段的引物。

上述煙曲霉單寧酶突變體在提高柿子汁抗氧化中的應用。

本發明的有益效果：本發明通過對單寧酶AfTanA中Kex2蛋白酶位點(K315-R316)對酶性質的影響分析，明確該位點對于酶的催化效率和穩定性影響較大，雙點的缺失突變AfTanΔKR單寧酶表現出更加優良的酶學特性，具有在食品工業中發揮巨大作用的潛力。

附圖說明

圖1為使用I-TASSER構建的AfTanA分子模型及Kex2位點分析。

圖2為單寧酶AfTanA及其突變體的SDS-PAGE電泳比較分析。

圖3為單寧酶突變體的酶學性質比較分析。

圖4為柿汁水解前后多酚類物質含量分析。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。

下述實施例所用材料與試劑：