[發明專利]一種牡蠣內源肽的提取和鑒定方法

有效

• 申請號: 201910721301.6
• 申請日: 2019-08-06
• 公開（公告）號: CN110346479B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 李兆杰;陳李品;張曉梅;張鴻偉;仇文峰;唐慶娟;薛長湖
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 劉艷青

1.一種牡蠣內源肽的提取和鑒定方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)對牡蠣進行前處理并提取牡蠣中的內源肽，獲得待測多肽濾液；

(2)通過超高相液相色譜-質譜法測定所獲得的多肽濾液；具體采用AB SCIEXTripleTOF? 5600檢測，流動相A：0.1% 甲酸-水，流動相B：0.1%甲酸-乙腈，流速：0.25mL/min，

梯度洗脫：

時間	A	B
0	95％	5％
2	95％	5％
27	80％	35％
37	65％	95％
39	20％	95％
42	20％	5％
46	95％	5％

TOF掃描范圍：350-1500Da，

正離子反應模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10；

(3)對步驟（2）得到的質譜數據進行在線數據庫比對，鑒定肽段；

(4)通過合成部分肽段并使用液相色譜-三重四級桿質譜建立的多反應監測分析方法，驗證肽段序列的正確性；具體采用AB SCIEX 5500 三重四級桿檢測，

流動相A：0.1% 甲酸-水，流動相B：0.1%甲酸-乙腈，流速：0.35 mL/min，梯度洗脫：

時間	A	B
0	95％	5％
0.5	95％	5％
17	65％	35％
17.5	5％	95％
20	5％	95％
20.1	95％	5％
25	95％	5％

電噴霧離子源，正離子反應模式，檢測方式：MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫度：475℃；鞘氣壓力：40；輔助氣壓力：6；

所述的步驟（1）前處理包括如下步驟：

1)牡蠣去殼取可食部位進行液氮速凍后均質，滅酶，待用；向滅酶后的牡蠣粉末樣品加入碳酸氫銨溶液，離心，收集上清，得肽粗提液；

2)向上述肽粗提液中加入二硫基蘇糖醇，水浴振搖反應，然后冷卻至室溫；

3)向步驟2）反應后的溶液中加入碘代乙酰胺溶液，室溫避光反應；

4)將步驟3）反應后的溶液使用固相萃取小柱脫鹽處理；

5)對除鹽后的溶液進行凍干處理，得到肽段；

6)凍干后的粉末狀樣品復溶；

7)在進一步上機分析之前，將反應液轉移到超濾膜的離心管，超濾離心，收集下層的待測多肽濾液，待上機檢測。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟（3）使用ProteinPilot軟件，檢索NCBI中牡蠣的蛋白數據庫，對質譜檢測結果進行比對分析。