[發明專利]重組人促卵泡激素及其制備方法

有效

• 申請號: 201910704414.5
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110305903B
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 彭紅衛;張玉晶;張磊;王沖;葉凡;俞峻紅;趙家跟;李曉鵬;俞亞波
• 申請（專利權）人: 江蘇璟澤生物醫藥有限公司;上海景澤生物技術有限公司;成都景澤生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/16;C07K14/59;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

本發明提供了一種重組人促卵泡激素及其制備方法。具體地，包括步驟：(1)將用于表達FSHα亞基的第一表達盒和用于表達FSHβ亞基的第二表達盒可操作地插入真核表達載體中，獲得能表達FSHα亞基蛋白和FSHβ亞基蛋白的轉染載體；(2)將所述轉染載體轉入真核細胞，從而獲得染色體中整合有所述第一表達盒和第二表達盒的經轉化的真核細胞；(3)在適合表達的條件下，培養所述的經轉化的真核細胞，表達所述的FSHα亞基和FSHβ亞基,從而獲得含重組促卵泡激素的發酵產物；(4)對所述發酵產物進行分離純化，從而制得重組促卵泡激素。本發明的方法可以替代現有人FSH的使用和制備方法，獲得的活性和純度均顯著提高的rhFSH。

技術領域

本發明屬于蛋白質技術領域，尤其涉及卵泡激素活性的多肽、多肽的制備方法。

背景技術

由于FSH合成和分泌不足所致的FSH濃度過低是女性和男性不孕不育的主要原因。在女性中，這一狀態的特征表現為不排卵或排卵異常；在男性中，可能會由于沒有足夠量的有活力的精子產生而導致不育。在不孕不育的診斷和治療中，FSH是發揮著重要作用的生物活性分子，在人類輔助生殖技術中FSH扮演著重要的角色，是目前市場上常見的用于治療男女不孕癥的主要藥物之一。

FSH是一種異源二聚體糖蛋白，分子量約為31KD，由非共價結合的α亞基和β亞基組成，其中α亞基相對分子質量約14KD，由92個氨基酸殘基組成，含2個N糖鏈、5個二硫鍵；β亞基相對分子質量約17KD，由111個氨基酸殘基組成，含2個N糖鏈、6個二硫鍵。α亞基和β亞基在轉錄后都經過糖基化，研究表明該蛋白質糖基化對其生物活性十分重要，是其發揮活性作用的關鍵。因此，必須采用真核細胞系統表達，該蛋白才有活性。

FSH骨架上糖鏈數目的多少及單糖組成在一定程度上決定著其體內生物活性的高低與半衰期的長短。采用化學或酶解的方法解離除去糖鏈，FSH的生物活性降低，直到消失，且α鏈上糖鏈的解離對激素的影響比β鏈更大。FSH在脫去糖鏈后，FSH與受體的結合能力反而會增強，但幾乎完全失去體內生物學活性，成為FSH的天然拮抗劑。FSH的糖基側鏈主要包含己糖、氨基己糖、巖藻糖及唾液酸4類分子，其中唾液酸的含量與FSH的體內生物學活性及半衰期密切相關。唾液酸含量高的FSH等電點較低，體內生物活性較高，半衰期也稍長；高唾液酸結構能夠降低FSH等電點，低等電點FSH蛋白在血液循環過程中與肝網狀內皮細胞表面特異性蛋白受體結合能力降低而不易被肝臟攝取降解，從而延長體內半衰期。

已經從垂體和絕經后尿液中分離出人FSH(EP 322,438、CN200910051483.7、CN200910048954.9、CN200910053274.6、CN200910048718.7、CN02136493.1)，

尿源提取的FSH在糖基結構上的差異而造成的FSH異構體生物活性上的差異，產品的質量和產量不高，污染大及潛在病原微生物感染。對于其制備，CN88103966號公開了采用免疫層析和逆相HPLC步驟從絕經后尿促性腺激素中純化人FSH(hFSH)。

目前，利用DNA重組技術生產的重組人卵泡刺激素(rhFSH)已問世，分別是瑞士雪蘭諾公司的果納芬和荷蘭歐加農公司的普麗康。在中國市場上，2004年上市的雪蘭諾公司的果納芬占壟斷地位，歐加農公司的普麗康2006年2月在中國上市，與雪蘭諾展開了激烈的市場爭奪。果納芬和普麗康屬于重組人促卵泡生成素，其中促卵泡生成素純度超過99％，作用穩定，因此具有很大優勢。由于技術力量和經費的原因，重組FSH產品明顯比尿源FSH產品更昂貴，一般的患者經濟上難以負擔。

因此，本領域迫切需要開發一種具有高純度和高比活性的重組FSH及其制備技術。

發明內容

本發明的目的就是提供一種具有高純度和高比活性的重組FSH及其制備技術。

在本發明的第一方面，提供了一種重組促卵泡激素的制備方法，其包括，