[發明專利]一種制備林蛙卵中多肽成分的方法

在審

• 申請號: 201910704311.9
• 申請日: 2019-07-31
• 公開（公告）號: CN110438186A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 王平;江瑜;金明哲
• 申請（專利權）人: 杭州婦幫醫療科技有限公司;浙江工業大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/14
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王靜

本發明提供一種制備林蛙卵中多肽成分的方法，該方法包括如下步驟：將新鮮林蛙卵干燥粉粹，加入水進行超聲提取，用NaOH溶液調節pH，加蛋白酶進行酶解，升溫滅酶，離心得水解液，干燥得林蛙卵粗多肽；以蒸餾水復溶，制備多肽溶液，上樣二級大孔樹脂，再用乙醇進行洗脫，回收洗脫液，旋蒸并干燥后得到林蛙卵多肽。

技術領域

本發明涉及一種超聲波輔助-多級大孔樹脂聯用制備林蛙卵中多肽成分的方法。

背景技術

林蛙是兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)林蛙屬(Rana)動物，又稱為蛤士蟆、雪蛤等。雌蛙取林蛙油后殘留大量的林蛙卵，是林蛙油生產的主要副產品之一，年產量約為林蛙油的10倍。林蛙卵中含有多不飽和脂肪酸、微量元素、雌二醇、孕酮、睪酮、卵泡激素、垂體泌乳素、蛋白質、維生素、磷脂酰膽堿、鞘磷脂和林芝酰乙醇胺等多種化合物，且其活性物質豐富，證明其存在藥用和保健品開發的價值。研究表明，林蛙卵對神經系統、心血管系統、內分泌系統均具有積極的改善作用，并且也具有抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等作用。

生物活性肽由2-20個氨基酸構成，分子質量小于6000Da，一般從動植物蛋白中獲得。其生物活性主要由氨基酸的組成和順序決定，主要包括抗氧化、降血壓、抗血栓、減脂、抑菌和抗炎等功效。目前，既能通過發酵、酶解等方法把蛋白質水解到一定的程度，使水解液中含有一定量的生物活性肽，也可以采取化學合成、酶法合成和DNA重組技術等定向合成法合成已知氨基酸序列的生物活性肽。然后通過超濾、凝膠色譜、離子交換色譜和高效逆流色譜等定向分離純化技術分別依據分子質量、帶電性和親疏水性進行生物活性肽的粗分離和精分離，各方法均有其不同的優點和局限性。

CN105296585A公開了一種林蛙卵多肽及其制備方法，包括如下步驟：1)粉碎篩分，將13g脫脂干燥林蛙卵用手提式高速中藥粉碎機粉碎，過60目篩；2)酶解，將步驟1)中制備的林蛙卵粉末加蒸餾水稀釋2.5倍，加熱至25℃并保持恒溫，用lmol/LNaOH溶液或lmol/LHCl溶液調節體系pH值為6，按照酶活添加量10400u/g料加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，胰蛋白酶：木瓜蛋白酶的酶活比為1.13，底物濃度10％，酶解溫度45℃，pH7.70，反應時間為3.5h；3)滅酶，反應至3.5h后，用lmol/LNaOH溶液或lmol/LHCl溶液調節pH值為7.0，水浴終止反應，水浴溫度為85℃，水浴時間8min；4)兩次離心，合并上清液，離心溫度4℃、轉速為8000r/min，時間為15min，首次離心后用蒸餾水洗滌沉淀進行二次離心；5)將上清液冷凍干燥，制得林蛙卵多肽凍干粉，研磨為均勻粉末，制得所述林蛙卵多肽。

發明內容

本發明的目的是采用一種超聲輔助-多級大孔樹脂聯用的方法從林蛙卵中制備多肽成分。本工藝利用超聲輔助加速林蛙卵有效組分提取，并顯著提高產品提取率，同時利用大孔樹脂進行純化，能夠放大實驗，有利于大批量生產及實現工業化生產。

本發明采用的技術方案是：

一種制備林蛙卵中多肽成分的方法，該方法包括如下步驟：將新鮮林蛙卵干燥粉粹，加入水進行超聲提取，用NaOH溶液調節pH，加蛋白酶進行酶解，升溫滅酶，離心得水解液，干燥得林蛙卵粗多肽；以蒸餾水復溶，制備多肽溶液，上樣二級大孔樹脂，再用乙醇進行洗脫，回收洗脫液，旋蒸并干燥后得到林蛙卵多肽。

在本發明一些實施方式中，所述林蛙卵與水的料液比為1:2～1:15，優選為1:4-1:10。

在本發明一些實施方式中，所述的超聲溫度為30～70℃，優選為40-60℃。

在本發明一些實施方式中，超聲提取時間為10～120min，優選為20～60min。

在本發明一些實施方式中，所述的蛋白酶為堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或者兩種以上。