[發(fā)明專利]一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910699795.2
• 申請(qǐng)日: 2019-07-31
• 公開（公告）號(hào): CN110317776A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何毅懷;陳歡;王娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

本發(fā)明提供了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立方法，涉及細(xì)胞模型技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述建立方法中，將處于生長對(duì)數(shù)期的LO2細(xì)胞給予毒胡蘿卜素干預(yù)，在所述干預(yù)48h后，得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型；所述LO2細(xì)胞與毒胡蘿卜素的比值為10⁶個(gè)細(xì)胞：5mL所述毒胡蘿卜素；所述毒胡蘿卜素的濃度為0.5μm。本發(fā)明所述建立方法通過毒胡蘿卜素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，行WB檢測(cè)TNFR1、NF?κB、gp130、c?Met、cyclin D1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)再生信號(hào)存在表達(dá)差異，正是c?Met、cyclin D1低表達(dá)，使得LO2細(xì)胞不能進(jìn)入S期，肝再生受阻。本發(fā)明所述方法可為研究肝臟疾病與肝再生奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞模型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立方法。

背景技術(shù)

肝臟具有重要的生理功能和很強(qiáng)的再生能力。當(dāng)肝臟受到損傷或被部分切除后，肝臟細(xì)胞通過增殖、生長，迅速恢復(fù)其原有體積和重量，該過程稱為肝再生。肝再生涉及細(xì)胞多種生理活動(dòng)，包括肝細(xì)胞激活、去分化、增殖及增殖調(diào)控、再分化、組織結(jié)構(gòu)和功能重建等，每個(gè)過程都受到嚴(yán)格的調(diào)控。體內(nèi)多種細(xì)胞因子和生長因子通過不同機(jī)制進(jìn)行肝再生調(diào)控。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)通過TNF-α/TNF-αI型受體(TNFR-1)/NF-κB/STAT3、IL-6/gp130/STAT3、HGF/c-Met通路等啟動(dòng)肝再生，細(xì)胞開始從原來的靜止的GO期進(jìn)入G1，并啟動(dòng)DNA合成，繼而進(jìn)入S期，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。在終止階段，腫瘤壞死因子-β(TNF-β)和一些細(xì)胞因子信號(hào)通路的反饋抑制和許多抑制因子對(duì)肝臟再生的負(fù)性調(diào)控從而使細(xì)胞停止生長。當(dāng)然，在肝再生過程中，cyclin D1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控也至關(guān)重要，其通過結(jié)合并激活Gl時(shí)期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，推動(dòng)細(xì)胞周期由Gl時(shí)期進(jìn)入到S時(shí)期。

在人體各組織、器官細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝細(xì)胞最為豐富，其作為一種重要的膜性網(wǎng)狀細(xì)胞器，主要參與蛋白質(zhì)、脂類和糖類的合成和代謝、調(diào)控鈣離子的儲(chǔ)存和釋放。當(dāng)肝臟遭受損傷時(shí)均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子水平驟變、錯(cuò)誤折疊蛋白和未折疊蛋白累積，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulum stress，ERS)，繼而出現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激廣泛存在于肝硬化、病毒型肝炎、藥物性肝炎等肝臟疾病。有肝損傷，就有肝再生相伴隨，而目前關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立方法比較復(fù)雜，對(duì)于肝細(xì)胞再生的研究較為淺顯。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立方法，可差異性影響細(xì)胞內(nèi)再生信號(hào)表達(dá)，從而簡單直接制備出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：

將處于生長對(duì)數(shù)期的LO2細(xì)胞給予毒胡蘿卜素干預(yù)，在所述干預(yù)48h后，得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型；所述LO2細(xì)胞與毒胡蘿卜素的比值為10⁶個(gè)細(xì)胞：5mL所述毒胡蘿卜素；所述毒胡蘿卜素的濃度為0.5μm。

優(yōu)選的，所述干預(yù)的方法，包括：(1)1mmol/L的TG母液用含10％胎牛血清培養(yǎng)基在室溫條件下稀釋至2000倍，得TG工作液；

(2)用PBS緩沖液清洗所述LO2細(xì)胞兩次，吸棄PBS后與所述TG工作液混合，將與TG工作液混合后的LO2細(xì)胞孵育48h。

優(yōu)選的，步驟(1)所述TG工作液的濃度為0.5μm。

優(yōu)選的，得所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型后，還包括檢測(cè)GRP78和肝細(xì)胞再生信號(hào)蛋白的表達(dá)量，和檢測(cè)細(xì)胞活力。

優(yōu)選的，所述肝細(xì)胞再生信號(hào)蛋白包括TNFR1、NF-κB、gp130、c-Met和cyclin D1。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)細(xì)胞活力的方法為MTS法。