[發明專利]一種敲除大腸桿菌醛脫氫酶基因提高1,2,4-丁三醇產量的方法

有效

• 申請號: 201910696030.3
• 申請日: 2019-07-30
• 公開（公告）號: CN110343653B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 諸葛斌;杜宣慧;狄瑩瑩;陸信曜;宗紅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N9/02;C12N15/113;C12N15/90;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明涉及一種敲除大腸桿菌醛脫氫酶基因提高1,2,4?丁三醇產量的方法，屬于基因工程技術領域。本方法利用的CRISPR?Cas9的方法敲除產1,2,4?丁三醇大腸桿菌副產物途徑的醛脫氫酶基因(feaB、aldB、ydcW)提高了1,2,4?丁三醇的產量。敲除菌E.coli W1、E.coli W2、E.coli W3好氧條件下發酵木糖合成1,2,4?丁三醇，3,4?二羥基丁酸分別減少了68.13％、60.94％、76.56％，BT的產量達到了16.50g/L、15.50g/L、16.00g/L，有效提高了1,2,4?丁三醇的產量。

技術領域

本發明涉及一種敲除大腸桿菌醛脫氫酶基因提高1,2,4-丁三醇產量的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

1,2,4-丁三醇(簡稱BT)是一種重要的化工原料，廣泛應用于軍工、醫藥、煙草等領域。目前，1,2,4-丁三醇的生產方法主要是化學合成法，由于化學法存在反應條件嚴苛、催化劑昂貴、環境污染嚴重、副產物復雜、提純難度大等顯著缺點，人們將目光轉移到具有綠色生產優勢的生物法上。BT為非天然化合物，2003年美國Frost研究發現(引用自文獻：NiuW,Molefe,Mapitso N,Frost,J.W.Microbial Synthesis of the Energetic MaterialPrecursor 1,2,4-Butanetriol[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(43):12998-9.)，大腸桿菌E.coli W3110在好氧條件下發酵木糖合成BT具有較高的摩爾轉化率、開發價值及應用前景等優勢。

目前，BT的生產利用的是化學合成法，但是化學法合成BT存在反應條件苛刻，環境污染嚴重等缺點。因此反應條件溫和、對環境友好的生物法得到了廣泛關注。BT是一種非天然化合物，自然界中不存在任何一種生物可以天然合成BT，因此BT的合成是通過人工構建合成途徑來完成。Frost等的研究發現，以大腸桿菌為宿主菌，由木糖變成木糖酸再經過脫水、脫羧、醇脫氫四步反應，可以得到BT。但在宿主大腸桿菌中，缺乏木糖脫氫酶和催化脫羧反應的酶，目前的研究主要集中在兩個酶的篩選上，以及對其分支代謝路徑的敲除上，在分支代謝路徑敲除的研究中，主要集中于底物木糖和中間代謝產物D-3-脫氧-甘油戊酮酸的其他代謝路徑，但是對D-3,4-二羥基丁醛的代謝途徑的敲除卻沒有報道。因此，提供一種提高木糖轉運率、降低副產物積累的方法，對1,2,4-丁三醇的工業生產有重要的應用價值。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種重組大腸桿菌，是以E.coli KXW3009為出發菌株，敲除了大腸桿菌醛脫氫酶基因feaB、aldB和/或ydcW，所述feaB編碼的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，所述aldB編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述ydcW編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述E.coli KXW3009的具體構建方法見景培源.多策略強化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大學,2018。

所述feaB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述aldB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述ydcW的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本發明的第二個目的是提供一種生產1,2,4-丁三醇的方法，應用上述重組大腸桿菌進行發酵。

所述發酵條件為：(1)挑取重組大腸桿菌單菌落接種到于液體LB培養基，35-39℃、200-220rpm培養10-20h；

(2)以1-5％(V/V)的接種量接種到新的液體LB培養基中，35-39℃、200-220rpm，搖瓶培養8-14h；