[發(fā)明專利]多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯及篩選多環(huán)芳烴降解突變菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910690812.6
• 申請(qǐng)日: 2019-07-29
• 公開（公告）號(hào): CN110438117B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘濤;王仁女;肖錕;劉聰洋;董偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/01
• 分類號(hào): C12N15/01;C12N13/00;C12Q1/06;B01J20/20;B01J20/28;C12R1/645
• 代理公司: 廣州瑞之凡知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44514
• 代理人: 黃愛君

本發(fā)明提供一種多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯，所述底物吸附內(nèi)襯為中空?qǐng)A柱形或者中空方柱形，其外徑比96孔板小孔內(nèi)徑小0.5～1.0mm，壁厚為0.1～0.3mm，柱高為3～7mm，壁體設(shè)有多個(gè)圓形或橢圓形通孔；所述96孔板小孔內(nèi)徑為10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直徑或長(zhǎng)軸為0.5～1.0mm。本發(fā)明屬于環(huán)保生物技術(shù)領(lǐng)域，提供的多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，實(shí)現(xiàn)了突變菌株的生長(zhǎng)情況的原位批量檢測(cè)；提供的篩選多環(huán)芳烴降解突變菌的方法，代替原有的三角瓶培養(yǎng)，無需將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸出再檢測(cè)，在節(jié)省成本的同時(shí)大大提高了效率，實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測(cè)和篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)保生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯及高通量篩選多環(huán)芳烴降解突變菌的方法。

背景技術(shù)

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)指分子中含有兩個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔铮ㄝ痢⑤臁⒎啤④诺壬习俜N化合物。多環(huán)芳烴的污染日益嚴(yán)重，由于其具有顯著的“三致”(致癌變、致突變、致畸)效應(yīng)，如何快速、有效治理成為亟待解決的任務(wù)。生物降解作為一種環(huán)境友好型處理方法得到廣泛關(guān)注，而降解菌種的篩選是生物降解法施行的必要基礎(chǔ)。當(dāng)前，從污染環(huán)境中篩選出的菌種已有大量報(bào)道。為提高這些野生菌種的降解效率，通過突變選育降解能力更強(qiáng)的突變菌株用于多環(huán)芳烴降解實(shí)踐是一個(gè)主要方法。

傳統(tǒng)的多環(huán)芳烴降解突變株選育方法一般包括以下幾個(gè)步驟：首先通過物理化學(xué)誘變后，挑選涂布獲得的單菌落。然后將每個(gè)單菌落接種到含有底物多環(huán)芳烴三角瓶中，檢驗(yàn)細(xì)胞生長(zhǎng)。傳統(tǒng)的多環(huán)芳烴降解方法需要將多環(huán)芳烴溶解于有機(jī)溶劑中，噴于三角瓶底部，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后再加培養(yǎng)基和接種，通過細(xì)胞生長(zhǎng)情況可判斷出誘變菌株的多環(huán)芳烴降解能力。傳統(tǒng)的多環(huán)芳烴降解方法往往涉及幾十甚至幾百個(gè)三角瓶的操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高，易污染，效率低，不利于高通量檢測(cè)，也無法實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)。

開發(fā)多環(huán)芳烴降解突變株的高通量篩選方法意義重大。應(yīng)用96孔板替代三角瓶可實(shí)現(xiàn)高通量的快速篩選，而96孔板也讓利用酶標(biāo)儀進(jìn)行原位高通量檢測(cè)成為可能。中國(guó)專利申請(qǐng)CN 109182183A公開了一種利用96孔板高通量篩選石油降解突變菌的方法，該方法使用液體石油作為底物，懸浮和分散的油滴會(huì)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的吸光度變化，但無法通過OD值檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，因此只能通過繁瑣的取樣-萃取-轉(zhuǎn)移等步驟來檢測(cè)底物的消耗來計(jì)算石油的降解。由于多環(huán)芳烴作為一種不溶于水的底物，若以晶體方式直接添加于96孔板中，會(huì)對(duì)酶標(biāo)儀的光路透過性產(chǎn)生影響，干擾測(cè)定；若以溶解于其他有機(jī)溶劑的方式添加于96孔板中，一方面添加的有機(jī)溶劑可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，另一方面也可能作為潛在的碳源被細(xì)胞利用，影響菌種選育效果。

因此，提供一種高通量、易推廣的多環(huán)芳烴降解突變菌的檢測(cè)方法，對(duì)于多環(huán)芳烴降解菌突變菌種資源的開發(fā)和污染治理具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為克服多環(huán)芳烴作為底物的添加方式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)原位檢測(cè)的影響，本發(fā)明提供了一種用于96孔板的多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯，該底物吸附內(nèi)襯可通過底物升華法在表面均勻的吸附一層多環(huán)芳烴，置于96孔板的小孔中，將底物固定于小孔的側(cè)壁附近，不遮擋小孔底部，也不會(huì)在培養(yǎng)過程中散落在培養(yǎng)液中，進(jìn)而避免了對(duì)光路透過性的影響，通過96孔板培養(yǎng)可使用酶標(biāo)儀在600nm波長(zhǎng)下原位檢測(cè)菌體生長(zhǎng)的吸光度值，依此判斷突變菌株的代謝能力。在提供多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了底物吸附內(nèi)襯的吸附方法，以及篩選多環(huán)芳烴降解突變菌的方法。本發(fā)明提供的多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯及篩選多環(huán)芳烴降解突變菌的方法，成本低，操作簡(jiǎn)便，易于推廣，大大提高了多環(huán)芳烴降解突變菌的篩選效率。

本發(fā)明的目的將通過下面的詳細(xì)描述來進(jìn)一步說明。

本發(fā)明提供一種多環(huán)芳烴底物吸附內(nèi)襯，所述底物吸附內(nèi)襯為中空?qǐng)A柱形或者中空方柱形，其外徑比96孔板小孔內(nèi)徑小0.5～1.0mm，壁厚為0.1～0.3mm，柱高為3～7mm，壁體設(shè)有多個(gè)圓形或橢圓形通孔；所述96孔板小孔內(nèi)徑為10.7±0.2mm或6.8±0.2mm，所述通孔的直徑或長(zhǎng)軸為0.5～1.0mm。