[發明專利]一種分離提純骨髓間充質干細胞亞群的方法

在審

• 申請號: 201910643419.1
• 申請日: 2019-07-17
• 公開（公告）號: CN110272865A
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 陶琳;陶正博;溫凱程
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發明公開了一種分離提純骨髓間充質干細胞亞群的方法，所述方法具體包括以下步驟：(1)從健康成人骨髓中通過密度梯度離心的方法獲得單個核細胞；(2)免疫磁珠篩選骨髓單個核細胞以獲得BMSC；(3)對步驟(2)中獲得BMSC進行流式分選，獲得各類不同的細胞亞群；(4)對步驟(2)(3)中獲得的BMSC進行單細胞轉錄組測序，檢測細胞的基因表達。本發明取骨髓進行單個核細胞分離，采用首創的階梯分離法，獲得骨髓間充質干細胞(BMSC)中具有不同功能的細胞亞群，并通過單細胞轉錄組測序手段鑒定其功能。本發明能夠解決現階段BMSC分化效果難以控制，細胞治療的有效成分少，療效不佳等問題。

技術領域

本發明涉及一種通過細胞表面標記特異性分離提純人骨髓間充質干細胞亞群的方法。

背景技術

骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)是存在于骨髓中的除造血干細胞以外的另一類具有“無限”增殖和多向分化潛能的干細胞。在一定的誘導條件下，這類細胞可定向分化為各胚層來源組織，特別是中胚層和神經外胚層來源的組織細胞。例如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、肌肉細胞和神經細胞等。BMSC具有貼壁易生長，體外易分離、擴增，外源性基因的易轉入和表達的特性，被全球專家學者認為是干細胞治療的一種理想細胞類型。

近年來，干細胞治療已成為生物醫學研究的難點和熱點問題，BMSC的治療效果也被廣泛認可，但是由于其多向分化能力，不僅具有成骨分化功能，還有調節造血、免疫抑制、成脂成纖維等作用，分化效果難以控制，也導致干細胞治療的局限性。針對上述問題，發明人首次證實BMSC中存在更為精細的功能分群，其不同亞群具有顯著的基因表達差異，在人群中發揮不同的功能。

發明內容

針對原有技術，為了彌補BMSC治療中有效分化細胞含量低的不足，發明人選用前期首次發現BMSC各細胞亞群特異性表達的表面抗原，通過聯合BMSC的特征表面抗原CD271，提供了一種簡單高效的全新方法，可特異性分離提純具有不同作用的細胞亞群，可用來治療多種疾病。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種分離提純骨髓間充質干細胞亞群的方法，所述方法具體包括以下步驟：

(1)從健康成人骨髓中通過密度梯度離心的方法獲得單個核細胞；

(2)免疫磁珠篩選骨髓單個核細胞以獲得BMSC；

(3)對步驟(2)中獲得BMSC進行流式分選，獲得各類不同的細胞亞群；

(4)對步驟(2)(3)中獲得的BMSC進行單細胞轉錄組測序，檢測細胞的基因表達。

本發明所述的一種分離提純骨髓間充質干細胞亞群的方法中，步驟(1)所述的健康人骨髓來源于自體或異體，獲得途徑可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓庫直接購買的健康人骨髓樣本。

本發明所述的一種分離提純骨髓間充質干細胞亞群的方法中，步驟(1)所述的密度梯度離心以獲取單個核細胞的操作為：

①將采血管經酒精浸潤的無塵紙擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分裝到15ml的離心管中，每管骨髓9ml，加入1.5ml PE buffer稀釋，并通過提前雙面潤濕的100μm篩網過濾；

②在新的15ml離心管底部加4.5ml Ficoll-Pague分離液，傾斜離心管，再將濾過的骨髓，緩慢加到Ficoll-Pague分離液面上，使其呈清晰的界面，盡量避免出現骨髓侵入到分離液面之下，在離心力為500g、溫度為20度的條件下離心35分鐘；

③離心后液面將分為4層，從底部向上分別為紅細胞、Ficoll層、白膜層和上清液層，吸棄上清液層，緩慢吸取白膜層細胞至新的50ml離心管中，加PE buffer 12ml，混勻洗滌，在離心力為300g、溫度為20度的條件下離心10分鐘；