[發明專利]6個懷遠石榴優良品種的SSR指紋圖譜及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201910631034.3
• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號: CN110283930B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 徐義流;秦改花;劉春燕;黎積譽;高正輝;齊永杰;潘海發;伊興凱;張曉玲
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院園藝研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 杭州奧創知識產權代理有限公司 33272
• 代理人: 趙梅

1.用于構建6個懷遠石榴優良品種的SSR指紋圖譜的SSR引物組，其特征是，

所述6個懷遠石榴優良品種分別為：白玉石籽、大笨子、紅粉皮、紅玉石籽、瑪瑙籽、晶花玉石籽；

所述SSR引物組為8對SSR引物，分別為：PG080、PG130、PG139、PG152、PG098、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-16所示。

2.利用權利要求1所述的SSR引物組構建6個懷遠石榴優良品種的SSR指紋圖譜的方法，其特征是，包括如下步驟：

（1）采用CTAB法提取DNA，加入50μL 0.1M的TE緩沖液，溶解過夜，-20℃保存備用；

（2）采用8對引物，以提取DNA為模版，進行PCR擴增，PCR擴增采用20μL的反應體系，含1.0ng DNA，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物，4mM MgCl₂，400μM dNTPs，1.0U Taq-DNA酶，加ddH₂O至總體積20μL，PCR采用touchdown反應，反應條件如下：5min，95℃；接下來11個循環，每個循環后退火溫度下降0.8℃，每個循環程序如下：30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃；22個循環，每個循環程序如下：30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃；最后72℃延伸8min；

（3）PCR產物用毛細管電泳確定片段大小，毛細管電泳按照以下步驟進行，將6-FAM或HEX熒光標記的PCR產物用超純水稀釋30倍，吸取1μL產物加入到DNA分析儀專用深孔板孔中；板中各孔分別加入0.1μL LIZ 500分子量內標和8.9μL去離子甲酰胺；95℃變性5min，于4℃冷卻10min；瞬時離心10s后置放到DNA分析儀上進行自動熒光檢測；

（4）使用Genemapper軟件分析SSR擴增數據，利用SSR毛細管電泳檢測擴增片段峰，橫坐標為片段大小，縱坐標為熒光強度值；純合位點的等位變異大小數據記錄為X/X，其中X為該位點等位變異的大小；雜合位點的等位變異數據記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異，小片段在前，大片段在后；

8個位點的數據整合在一起形成6個懷遠石榴品種的SSR指紋圖譜，品種間差異位點數≥3為不同品種；品種間差異位點數3為近似品種；構建的6個石榴品種的SSR指紋圖譜如表1所示：

表1 6個懷遠石榴優良品種的SSR指紋圖譜

6個品種間的差異位點數均≥3。

3.權利要求1所述的用于構建6個懷遠石榴優良品種的SSR指紋圖譜的SSR引物組在石榴品種鑒定方面的應用，其特征是，所述石榴品種為6個懷遠石榴優良品種，分別為：白玉石籽、大笨子、紅粉皮、紅玉石籽、瑪瑙籽、晶花玉石籽。