[發明專利]一種發光細菌的生長作用和急慢性毒性檢測方法

在審

• 申請號: 201910623712.1
• 申請日: 2019-07-11
• 公開（公告）號: CN110441292A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 袁楠楠;鮑安平
• 申請（專利權）人: 南京信息職業技術學院
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/31;G01N1/34;G01N1/38
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

本發明公開了一種發光細菌的生長作用和急慢性毒性檢測方法，包括步驟：制備實驗樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品；制備發光細菌菌液；將發光細菌菌液加到96孔細胞培養板中，然后置于酶標儀，30min后測定初始光密度值和初始生物發光值；向發光細菌菌液中加入實驗樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品，前1h每30min測一次光密度值和生物發光值，隨后每1h測一次，測試不低于24h；獲取光密度突變時間和生物發光突變時間；計算急性發光抑制率、慢性發光抑制率和生長抑制率。本發明可同時評估待測物質對發光細菌的生長作用、急性和慢性毒性效應，準確率高，實現了毒性測試的高通量化，測試效率高。

技術領域

本發明屬于環境檢測技術領域，具體涉及一種發光細菌的生長作用和急慢性毒性檢測方法。

背景技術

發光細菌是一種在正常新陳代謝過程中可自發藍綠色光的化能自養型微生物，發光主要依靠由NAD(P)H：FMN氧化還原酶以及熒光素酶組成的生物發光酶系統，發光強度與細胞內新陳代謝緊密相連，當發光細菌的活性較高時，細胞新陳代謝ATP含量較高，發光則較強。反之，如果發光細菌受到某些因素影響細胞活性被抑制，ATP含量則會響應并隨之下降，從而導致發光細菌的發光變弱，甚至停止發光。傳統的發光細菌毒性實驗則根據此原理，通過檢測發光細菌的發光強度，并與空白組做比較，表征被檢測物質的毒性。

傳統的發光細菌毒性實驗常被應用于環境污染監測，如發明專利申請一種基于發光細菌法的土壤綜合毒性檢測方法(申請號為201710407732.6，公布號為CN 107238599A)，包括步驟：對土壤樣品進行預處理；稱取土樣，過尼龍篩后用甲醇索氏提取，減壓旋轉蒸發濃縮，加入乙二醇后將該混合物繼續濃縮備用；取培養后的發光細菌培養液，加入樣品浸提液、15wt.％NaCl溶液和純凈水，混勻后靜置，測定發光強度；樣品毒性的表達：測量靜置后混合液的發光抑制率、氯化汞當量濃度；如發明專利利用淡水發光細菌檢測銅污染土壤急性毒性的方法(申請號為200910079402.4，授權公告號為CN 101487798 B)，具體方法選用淡水發光細菌作為檢測用細菌，包括以下步驟：第一步用土壤背景溶液制備淡水發光細菌的菌懸液；第二步采用雙室離心法提取土壤孔隙水；第三步檢測土壤樣品的毒性。

但是目前的發光細菌毒性檢測方法通常只有急性(5～30min)發光毒性檢測這一個毒理學端點，只能評估待測物質對發光細菌的發光作用的急性效應，從而忽略物質對發光細菌造成的延遲毒性作用，或者發光作用之外的效應，如生長作用。此外，現有的細菌毒性檢測方法是使用發光儀測試發光強度，評估方式單一，且每次所測樣品數量有限，測試效率低。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種發光細菌的生長作用和急慢性毒性檢測方法，同時評估待測物質對發光細菌的生長作用、急性和慢性毒性效應，準確率高，實現了毒性測試的高通量化，測試效率高。

本發明提供了如下的技術方案：

一種發光細菌的生長作用和急慢性毒性檢測方法，包括以下步驟：

制備若干不同濃度的實驗樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品；

在無菌條件下制備發光細菌菌液；

將所述發光細菌菌液加入到96孔細胞培養板中，然后將96孔細胞培養板置于酶標儀中，30min后測定初始光密度值和初始生物發光值；

向發光細菌菌液中加入實驗樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品，前1h每30min測一次光密度值和生物發光值，隨后每1h測一次，測試不低于24h，測試過程中每5～10min振動一次96孔細胞培養板；

做出陰性對照樣品的光密度值和生物發光值隨時間變化曲線，分別獲得光密度突變時間和生物發光突變時間；