[發明專利]一種從微量松根或菌根組織中提取高質量總RNA的方法在審
| 申請號： | 201910614314.3 | 申請日： | 2019-07-09 |
| 公開（公告）號： | CN110283817A | 公開（公告）日： | 2019-09-27 |
| 發明（設計）人： | 唐年武;于富強 | 申請（專利權）人： | 中國科學院昆明植物研究所 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務所 11569 | 代理人： | 瞿曉晶 |
| 地址： | 650201 *** | 國省代碼： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 總RNA 菌根 松根 數據一致性 最大程度地 轉錄 高效提取 馬尾松根 微量組織 組織破碎 測序 得率 降解 裂解 沉淀 破碎 火炬 保留 重復 組建 改進 研究 | ||
1.一種從微量松根或菌根組織中提取總RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將微量松根或菌根組織置于破碎、裂解專用管中，投入液氮中迅速冷凍，得到經過冷凍的微量組織；所述微量松根或菌根組織的重量為0.009～0.013g；
(2)將經過冷凍的所述微量組織置于組織研磨儀上，60Hz研磨30～40s后，重新置于液氮中；
(3)向所述破碎、裂解專用管中加入1mL改良CTAB裂解液，渦旋振蕩10～20s后65℃溫育10～15min，得到溫育后的裂解勻漿；每升所述改良CTAB裂解液中包括以下體積百分含量的試劑：2％CTAB，2％PVP，2％β-巰基乙醇和100mM Tris-HCl，25mM EDTA和2M NaCl；
(4)收集溫育后的裂解勻漿與等體積的氯仿/異戊醇混合，渦旋5～10s后，10000g、4℃離心10min；所述氯仿/異戊醇中氯仿和異戊醇的體積比為24:1；
(5)收集離心后的上清液與等體積的氯仿/異戊醇混合，渦旋5～10s后，12000g、4℃再次離心10min；所述氯仿/異戊醇中氯仿和異戊醇的體積比為24:1；
(6)收集再次離心后的上清液與1/2體積的LiCl溶液混合，上下顛倒混勻后于4℃冰箱中沉淀12～16h；所述LiCl溶液的濃度為8M；
(7)12000g、4℃離心10min，棄上清得沉淀的總RNA；
(8)將所述沉淀的總RNA與體積濃度為70％的乙醇溶液混合洗滌后，10000g、4℃離心5min，棄上清得清洗總RNA；
(9)將所述清洗總RNA再與體積濃度為70％的乙醇溶液混合洗滌后，10000g、4℃離心5min，棄上清并干燥，得純化的總RNA；
(10)向所述純化的總RNA中加入30μL無DNA酶及RNA酶超純水，得純化的總RNA溶液。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)所述組織研磨儀在使用前，還包括預冷。
3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述預冷為將所述組織磨儀的底座和蓋板在液氮中浸泡5min以上。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(3)所述改良CTAB裂解液中，還包括亞精胺或核酸酶抑制劑焦磷酸二乙酯。
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述亞精胺的質量體積濃度為0.5g/L。
6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述核酸酶抑制劑焦磷酸二乙酯的體積濃度為0.1～1％。
7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(10)得所述純化的總RNA溶液后，還包括在Nanodrop ONE和Agilent Bioanalyzer 2100上測定RNA的純度和完整性。
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