[發(fā)明專利]一種堿性蛋白酶的工業(yè)化液體發(fā)酵方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910601873.0
• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號(hào): CN110241101A
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳永忠;陳圣卿
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇邦臣生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/54
• 分類號(hào): C12N9/54;C12R1/07
• 代理公司: 北京七夏專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11632
• 代理人: 王曉豐

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的講涉及一種堿性蛋白酶的工業(yè)化液體發(fā)酵方法，包括如下步驟：①號(hào)種子培養(yǎng)：將菌種接入1500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升；②號(hào)種子培養(yǎng)：將①號(hào)種子按照10％的接種量接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升；培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；本發(fā)明并優(yōu)化了相應(yīng)的發(fā)酵機(jī)制，該發(fā)酵機(jī)制，過程操作簡便，培養(yǎng)條件溫和，發(fā)酵酶活力在100000u/ml以上，降低了單位酶活的生產(chǎn)成本，大大滿足了市場的需要。使堿性蛋白酶能夠在洗滌劑、飼料、皮革制造等行業(yè)中得到更為廣泛的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的講涉及一種堿性蛋白酶的工業(yè)化液體發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

堿性蛋白酶(AlkalineProtease)是一種最適PH為9-11的蛋白酶類，分子量26000-34000道爾頓，一般在PH5-10時(shí)較穩(wěn)定。由于其活性中心含絲氨酸(Ser)，故屬于絲氨酸蛋白酶。它不但能水解肽鍵，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的功能。廣泛應(yīng)用于洗滌劑、醫(yī)療、絲綢、制革等行業(yè)。

近年來，隨著人們生活水平的提高以及環(huán)境保護(hù)的需要，含磷洗滌劑已基本被淘汰，取而代之的是各種加酶洗滌劑的大量應(yīng)用。因洗滌劑的水溶液一般呈堿性，PH大約為9-11，故堿性蛋白酶已成為目前市場上使用最多的洗滌添加劑。它能大幅度提高洗滌去污能力，特別對(duì)奶漬、汗?jié)n、血漬、油漬等蛋白類污垢,具有獨(dú)特的洗滌效果。隨著洗滌劑行業(yè)迅速發(fā)展，洗滌劑的用量增長迅速，市場對(duì)堿性蛋白酶的需求亦大幅度增加。

但是，目前市場上可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的堿性蛋白酶酶活力普遍較低，使得單位酶活力所對(duì)應(yīng)的生產(chǎn)成本相對(duì)較高，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前洗滌劑等行業(yè)的需求。如何提高堿性蛋白酶的酶活力，降低生產(chǎn)成本已成為現(xiàn)在最需要解決的問題。因此，使用改進(jìn)發(fā)酵工藝，提高堿性蛋白酶酶活力對(duì)酶制劑工業(yè)具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

因此本發(fā)明提出一種堿性蛋白酶的工業(yè)化液體發(fā)酵方法

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種堿性蛋白酶的工業(yè)化液體發(fā)酵方法，包括如下步驟：①號(hào)種子培養(yǎng)：將能生產(chǎn)堿性蛋白酶的菌種接入1500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36-38℃，培養(yǎng)時(shí)間6-15h；②號(hào)種子培養(yǎng)：將①號(hào)種子按照10％的接種量接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度36-38℃，培養(yǎng)時(shí)間6-15h；培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，所述發(fā)酵所用培養(yǎng)基為：發(fā)酵培養(yǎng)基g/L：酵母浸粉15-20、棉籽餅粉25-35、麥芽糊精90-110、檸檬酸鈉1-5、氯化鈣2-5、K2HPO415-20、pH自然、溶劑為水；發(fā)酵條件為：溫度：30-40℃；轉(zhuǎn)速：100～600r/min；通風(fēng)量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧維持在20～30％，發(fā)酵過程中自動(dòng)流加氨水及20％(v/v)的鹽酸，使發(fā)酵液pH值維持在7.0。

進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)：將①號(hào)種子罐菌種以5-10％接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度32-36℃，攪拌速度200-700r/m，通風(fēng)量V/V1:1-3,罐壓0.05MPa,培養(yǎng)時(shí)間70-100h；

溶解氧控制：通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量，控制溶解氧15-30％；

pH值控制：通過補(bǔ)氨水或稀磷酸，控制發(fā)酵過程中pH值值保持在7.0-7.5；

補(bǔ)料控制：當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml時(shí)，開始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料量使發(fā)酵液還原糖含量維持為2mg/ml-5mg/ml。

進(jìn)一步地，所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：麥芽糊精45％，豆餅水解液4.0％，不足部分純凈水補(bǔ)足，pH78.0，123℃滅菌40min。