[發明專利]一種用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201910588667.0
• 申請日: 2019-07-02
• 公開（公告）號: CN110361442B
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發明（設計）人: 王金恒;劉金保;涂成功;張慧;謝茂彬
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N33/68;C12N5/0775
• 代理公司: 廣州三辰專利事務所(普通合伙) 44227
• 代理人: 范欽正

1.一種用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體，其特征在于：包括能用于質譜流式檢測的重金屬標簽化合物，所述重金屬標簽化合物分布在外泌體內腔中；所述重金屬標簽化合物通過電穿孔及孵育方式導入外泌體中；所述重金屬標簽化合物是指包含有原子量在75-209間的元素的化合物。

2.根據權利要求1所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體，其特征在于：所述重金屬標簽化合物可與細胞內蛋白、RNA、DNA中的至少一種相結合。

3.根據權利要求1所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體，其特征在于：所述重金屬標簽化合物為含有I¹²⁷的碘去氧尿啶或碘化丙啶，含有Rh¹⁰³或Ir¹⁹¹或Ir¹⁹³的DNA插入劑，含有Pt¹⁹⁴和Pt¹⁹⁵的順鉑中的至少一種。

4.權利要求1-3任一項所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體的制備方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

1)提取外泌體：通過梯度離心、濃縮，沉淀獲取外泌體；或者通過超高速離心獲得外泌體；

2)重金屬標簽導入：步驟1)獲得的外泌體與重金屬標簽化合物通過電穿孔及孵育方式，將重金屬標簽化合物導入外泌體中；

3)獲取具有重金屬標簽的外泌體：利用沉淀試劑盒或者超高速離心分離，去除沒有被外泌體包裹的游離重金屬標簽化合物，獲得用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體。

5.根據權利要求4所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體的制備方法，其特征在于：步驟1)中所述梯度離心、濃縮，沉淀獲取外泌體，其具體制備方法的步驟如下：將細胞在培養基中有血清培養2天，用PBS洗3次，后用無血清培養1-2天；收集培養基的上清液，對上清液依次采用300g×5min、2000g×5min離心去除培養液中的死細胞及細胞碎片，再用0.22um濾膜去除凋亡小體，大囊泡，進一步使用100KD超濾管以1500g轉速濃縮上清，去除大部分蛋白及小分子，沉淀試劑4℃過夜沉淀外泌體，1500g×30min去除上清，再次1500g×5min去除殘余上清，PBS重懸后獲得外泌體；

步驟1)中所述通過超高速離心獲得外泌體，其具體制備方法的步驟如下：將細胞在培養基中有血清培養2天，用PBS洗3次，后用無血清培養2天；收集培養基的上清液，對上清液依次采用300g×5min、3000g×5min、10000g×30min離心去除培養液中的死細胞及細胞碎片以及大囊泡，而后通過100000g×70-90min得到含有外泌體的沉淀，PBS重懸后獲得外泌體。

6.根據權利要求4所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體的制備方法，其特征在于：步驟2)中所述電穿孔及孵育的條件設置為：250V，100ms，6次，電穿孔后37℃孵育30min。

7.根據權利要求4所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體的制備方法，其特征在于：步驟3)中所述沉淀試劑盒為ExoQuick沉淀試劑盒；具體沉淀試劑的沉淀步驟如下：利用沉淀試劑對上述外泌體進行4℃過夜沉淀，1500g×30min,去除上清，再次1500g×5min,使用PBS重懸外泌體，10000g×5min離心，將可能出現蛋白、外泌體或者藥物的聚集體沉淀去除，上清即為具有重金屬標簽化合物的外泌體；

步驟3)中所述超高速離心，具體步驟如下：外泌體進行100000g×70-90min離心得到含有外泌體的沉淀，PBS重懸后，再經過10000g×5min離心，將可能出現蛋白、外泌體或者藥物的聚集體沉淀去除，上清即為具有重金屬標簽化合物的外泌體。

8.權利要求1-3任一項所述的用于質譜流式細胞儀檢測的外泌體的應用，其特征在于：用于高通量的單細胞分析外泌體的攝取。