[發明專利]一株利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC及其應用

在審

• 申請號: 201910565374.0
• 申請日: 2019-06-27
• 公開（公告）號: CN110205303A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 胥傳來;沈心怡;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K14/795;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

本發明涉及一株利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明細胞株NLC，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號CGMCC No.17391。將利福平完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化，通過免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐劑，多次加強免疫用不完全弗氏佐劑，最后一次用利福平完全抗原沖刺免疫（腹腔注射）。將高效價，低IC₅₀小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合；再經過間接競爭酶聯免疫法篩選并三次亞克隆，最終得到雜交瘤細胞株NLC。此細胞株分泌的單克隆抗體，對利福平具有較好的特異性和檢測靈敏度，可實現對水產品中利福平殘留量的檢測，具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及一株利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

利福平（Rifampicin，RFP）又名甲哌利福霉素，是一種半合成利福霉素類抗生素，為廣譜抗生素，對結核桿菌有高度抗菌活性，臨床主要用于抗結核治療，也是一種水產專用的漁藥。利福平適用于海水養殖魚、蝦、蟹類等因弧菌、球菌引起的出血、腹水、潰爛、腸炎、白便；對海參因細菌感染導致的化皮，腫嘴；在魚、蝦、蟹、貝類育苗期間，對發光菌、弧菌等具有強力抑殺作用。利福平雖未批準用于水產動物，但在實際水產養殖中使用廣泛，在人體內蓄積對健康產生危害，其耐藥性也有轉移擴散到人體的風險，對消費者的健康存在很大的隱患。有報道指出利福平可致人肝功能、腎功能損害以及各種皮疹等疾病。

目前國內外對水產品中使用的利福平沒有特定的限量標準。我國在《2018年獸藥殘留標準制修訂項目的通知》中提出了制定《水產品中利福平殘留量的測定LC-MS-MS》標準。因此，為保障水產品質量安全和消費者身體健康，促進水產養殖業的健康、可持續發展，有必要對水產品中的利福平殘留進行檢測和控制。目前對利福平的檢測主要是儀器檢測，尤其以高效液相色譜法為主。然而這些儀器分析方法的前處理復雜，需要消耗大量人力物力，不適用于大量樣品的快速檢測；因此為了維護消費者的利益，建立一種針對利福平的高效、快速的檢測方法勢在必行。

酶聯免疫法（ELISA）是一種極為簡便、快速的檢測方法，可實現大量樣品的快速檢測，且檢測時對樣本的純度要求不高。因此，建立高效的免疫學檢測方法很有必要，而建立此方法的一個重要前提即需篩選出針對利福平的高特異性單克隆單體。

發明內容

本發明的目的是提供一株利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC，由該細胞株制備的抗體對利福平具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立利福平的免疫學檢測方法。

本發明的技術方案，一株利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏編號CGMCCNo.17391。

利福平單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.17391的利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC分泌產生。

所述利福平單克隆抗體的應用，用于食品安全檢測中利福平殘留的分析檢測。

本發明提供的利福平單克隆抗體雜交瘤細胞株NLC的制備基本步驟為：

（1）完全抗原RFP-CDI-KLH的制備：稱取11.0mgRFP（利福平與血藍蛋白（KLH）摩爾比為6000：1）和30.3mg N,N'-羰基二咪唑（CDI），溶解于600 μL無水1,4-二氧六環中，48-52℃左右活化6-8h，加入100μL水終止反應，稱為A液；取10 mg KLH，加入等體積pH=8.6、0.01M碳酸鹽緩沖溶液CB，稱為B液；再逐滴將A液緩慢加入到B液中，室溫反應24h；即得偶聯物RFP-CDI-KLH混合液；然后用0.01M PBS（pH=7.2）溶液透析三天，除去未反應的小分子半抗原，得到完全抗原RFP-CDI-KLH，并通過紫外吸收掃描方法進行鑒定；