[發明專利]一種單核苷酸精度的tRNA甲基化高通量測序方法及其應用

在審

• 申請號: 201910550337.2
• 申請日: 2019-06-24
• 公開（公告）號: CN110452957A
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 林水賓
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G16B30/00
• 代理公司: 44416 廣州勝沃園專利代理有限公司
• 代理人: 張帥<國際申請>=<國際公布>=<進入國

1.一種單核苷酸精度的tRNA甲基化高通量測序方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、小RNA的提取和去甲基化；

S2、tRNA m⁷G位點的還原和裂解；

S3、cDNA文庫的建立；

S4、利用生物信息學分析m⁷G修飾位點。

2.如權利要求1所述的單核苷酸精度的tRNA甲基化高通量測序方法，其特征在于，所述步驟S1中小RNA提取的具體操作為：

(1)利用Trizol法提取總RNA，最終經稀釋，得濃度為1-2μg/μL的RNA稀釋液；

(2)取步驟(1)所得的濃度為1-2μg/μL的RNA稀釋液25-50μL，利用mirVana miRNAIsolation Kit提取小RNA，并經1％的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA長度，均在200nt，即得。

3.如權利要求1所述的單核苷酸精度的tRNA甲基化高通量測序方法，其特征在于，所述步驟S1中小RNA去甲基化的具體操作為：

(1)將質粒pET30a-AlkB，pET30a-AlkB-D135S質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞BL21，待重組蛋白表達后，進一步純化，得重組細菌野生型AlkB蛋白和突變型AlkB-D135S蛋白；

(2)利用SDS-PAGE凝膠電泳和膠體藍試劑盒檢測步驟(1)所得重組細菌野生型AlkB蛋白和突變型AlkB-D135S蛋白的純度，得濃度為0.2-0.5μg/μL的AlkB蛋白和AlkB-D135S蛋白；

(3)將步驟(2)所得濃度為0.2-0.5μg/μL的AlkB蛋白和AlkB-D135S蛋白進行小RNA的去甲基化修飾，配制成100μL是體系：

將以上混合物置于室溫孵育兩個小時，加入5μL 0.5M EDTA終止反應。再加入300μL水以及400μL由酸酚:氯仿:異戊醇按質量比為125：24：1組成的混合液，渦旋一分鐘，室溫下16000×g離心5分鐘，10μL 3M pH5.2乙酸鈉和400μL無水乙醇重新沉淀RNA，75％酒精洗滌RNA沉淀，離心，干燥，取16μL水重新溶解，即得去甲基化的小RNA。

4.如權利要求1所述的單核苷酸精度的tRNA甲基化高通量測序方法，其特征在于，所述步驟S2中tRNA m⁷G位點的還原和裂解的具體操作步驟為：

(1)向已獲得的去甲基化的小分子RNA中，加入m⁷GTP甲基載體，配制成50μL的體系，于冰上混合，得混合物I；

(2)向步驟S1所得混合物I中加入加入0.5M，pH8.2 Tris配制的0.2M硼氫化鈉，于黑暗條件下冰上反應30分鐘，對RNA進行還原，得新RNA；

(3)向步驟(2)所得新RNA中加入10μL 3M pH5.2乙酸鈉和400μL無水乙醇，重新沉淀RNA，75％酒精洗滌RNA沉淀，于1200rpm的條件下離心，干燥，得重新沉淀的RNA；

(4)向步驟(3)所得重新沉淀的RNA中加入由水：冰乙酸：苯胺按7:3:1的比例組成的RNA裂解液，置于黑暗條件下27℃的溫度下孵育2h，重復步驟(3)，將RNA重懸于水，得稀釋后的RNA溶液；

(5)將步驟(4)所得稀釋后的RNA溶液用tRNA LysCTT探針進行Northern blotting分析，檢測小RNA裂解產物，即得RNA裂解產物。

5.如權利要求4所述的單核苷酸精度的tRNA甲基化高通量測序方法，其特征在于，所述步驟S2中tRNA m⁷G位點的還原和裂解過程中步驟(2)配制的50μL體系包含：去甲基化的小RNA 9μL，終濃度為2mM的10mM m⁷GTP 10μL，終濃度為0.5M，pH值為8.2的1M Tris 25μL，H₂O6μL。