[發明專利]一種禽傳染性支氣管炎病毒的RT-RAA檢測方法

在審

• 申請號: 201910546537.0
• 申請日: 2019-06-24
• 公開（公告）號: CN110241261A
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 王素春;王楷宬;黃保續
• 申請（專利權）人: 中國動物衛生與流行病學中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供一種禽傳染性支氣管炎病毒RT?RAA檢測方法，包含有檢測禽傳染性支氣管炎病毒引物對和探針組，所述的引物對中，正向引物的序列為SEQ ID NO:1，反向引物的序列為SEQ ID NO:2，探針的序列為SEQ ID NO:3。本發明提供一種基于分子生物學的快速檢測禽傳染性支氣管炎病毒的方法，以實現對禽傳染性支氣管炎病毒進行安全、特異、快速、靈敏、簡單、高通量的快速檢測，從而彌補現有傳統檢測技術的不足。并且此方法非常適用于現場快速檢測，與PCR法相比，RT?RAA法是在恒溫下反應，操作簡單，擺脫了復雜儀器的束縛，不需變溫，大大縮短了反應時間。

技術領域

本發明屬于逆轉錄重組酶介導等溫擴增(Reverse transcription recombinaseaided amplification，RT-RAA)檢測技術領域，具體涉及一種禽傳染性支氣管炎病毒RT-RAA檢測方法。

背景技術

禽傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)可引起雞的一種急性、高度接觸性傳染的病毒性疾病，即禽傳染性支氣管炎。該病以咳嗽、氣管啰音和打噴嚏為主要特征，是對我國養雞業危害最為嚴重的病毒性傳染病之一，該病幾乎在世界范圍內所有的養雞國家存在，在我國的流行呈上升趨勢。IBV血清型眾多，目前已報道30余種，不同血清型毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異，相互間沒有或僅有部分交叉免疫性，近些年，隨著病毒的不斷突變，新的血清型不斷出現。但由于血清分型僅說明了IBV中和抗原位點的差異，不能反映基因組的變異機制，因此在實際檢測應用中收到限制。而利用分子生物學方法針對IBV的S1基因進行的基因分型得到普遍應用，但隨著病毒不斷變異，現有的基于S1基因的檢測方法已不能檢測所有基因型，急需建立能夠檢測所有基因型的現場快速檢測方法用于臨床檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種禽傳染性支氣管炎病毒RT-RAA檢測方法，以實現對禽傳染性支氣管炎病毒進行安全、特異、靈敏、快速、方便的檢測。

本發明首先提供一種檢測禽傳染性支氣管炎病毒引物對和探針組，分別是鑒定禽傳染性支氣管炎病毒N基因的引物對IBV forward、IBV reverse和探針IBV probe，其引物對和探針序列信息如下：

正向引物IBV forward：

5′-CGTACTAAAGGTAAGGAGGGAAATTTTGGTGATG-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物IBV reverse：

5′-CATCTGGTTGAAGYTTGGGCGTCACTCTACTT-3′(SEQ ID NO:2)

探針IBV probe：

5′-TGGTGATGACAAGATGAATGAGGAAGG/i6FAMdT/A/idSp//iBHQ1dT/AAGGATGGGCGTGTT-3′(SEQ ID NO:3)；

其中探針自5′端起第28位堿基T標記FAM發光基團，第29位堿基A后連接脫堿基位點四氫呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第30位堿基T標記BHQ1淬滅基團，3′端進行C3-spacer阻斷修飾。

本發明所提提供的引物對和探針組可用于制備檢測禽傳染性支氣管炎病毒的試劑盒；

所述的試劑盒，優選為RT-RAA檢測試劑盒。

本發明再一個方面提供檢測臨床樣品中禽傳染性支氣管炎病毒的RT-RAA檢測方法，包括如下的步驟：

1)配制RT-RAA反應體系