[發明專利]一種提高鉛DNAzyme穩定性的固定化酶方法及應用

有效

• 申請號: 201910522063.6
• 申請日: 2019-06-17
• 公開（公告）號: CN110438115B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 趙慧敏;吳煒浩;譚冰
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12Q1/44;G01N21/64
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 溫福雪;侯明遠

本發明屬于環境監測技術領域，提供一種提高鉛DNAzyme穩定性的固定化酶方法及應用。在常溫常壓下，利用仿生礦化的方法，在水相中合成沸石咪唑酯骨架?8固定化的生物復合材料。相對于游離的DNAzyme來說，ZIF?8保護層增加了DNAzyme對抗極端環境的能力，如DNA水解酶，擴展了鉛DNAzyme的檢測領域。建立了基于DNAzyme@ZIF?8生物復合材料的熒光傳感方法，實現了鉛離子的靈敏檢測。

技術領域

本發明屬于環境監測技術領域，涉及一種提高鉛DNAzyme穩定性的固定化酶方法及應用。

背景技術

由于工業活動的增加，自然環境中的重金屬污染逐漸成為一個嚴重的問題。通常，金屬離子可分為必需離子和非必要離子。非必需的重金屬，如鎘(Cd)，汞(Hg)，砷(As)和鉛(Pb)，即使微量接觸，也具有高毒性和致癌性。雖然需要銅(Cu)和鋅(Zn)等基本金屬來維持生命活動，但這些必需金屬在過量時也是有毒的。此外，由于它們不可生物降解和在食物鏈中的積累的性質，對人類健康和環境都可能會構成嚴重威脅。因此，必須在環境、食品和飲用水中量化這些金屬濃度。

傳統的定量方法，如原子吸收/發射光譜，電感耦合等離子體/原子發射光譜和冷氣相原子熒光光譜(CVAFS)，已廣泛應用于檢測金屬離子。雖然這些技術具有高選擇性和敏感性，但它們需要復雜且昂貴的儀器，尤其是用于從水樣中提取金屬離子的復雜化學過程，金屬離子的形態可能會發生變化。此外，傳統方法不能用作現場原位實時檢測，同時大規模測定重金屬可能會耗費大量人力、財力和實踐。相比之下，傳感器具有很大的現場原位實時檢測多種重金屬的潛力。納米技術的快速發展為傳感器的性能(靈敏度，選擇性和再現性)提高提供了新的機會。

最近，已經對DNAzymes進行了許多研究，特別是具有RNA切割性能的DNAzymes。DNAzymes最重要的實際應用之一是金屬離子檢測，因為它們具有很高的金屬離子選擇性，例如報道的Pb²⁺DNAzyme對于Pb²⁺的選擇性是其他競爭金屬離子選擇性的大約400,000倍(Chem.Commun.46(2010)3896–3898)，UO₂²⁺DNAzyme對于UO₂²⁺的選擇性是其他競爭金屬離子選擇性的約1,000,000倍(ChemBioChem 10(2009)486–492)。這種金屬選擇性可以在許多其他DNA酶中找到。因此，利用DNAzymes已經構建了很多熒光、比色和電化學傳感器，適用于各種金屬離子的檢測，如Hg²⁺，Pb²⁺，UO₂²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺等。然而天然酶對外界環境太敏感而不能應用于各種催化領域，特別是在工業中。實際上，有一系列因素導致酶失活，例如，極端pH(強酸和強堿)，熱，蛋白酶，表面活性劑等，DNAzymes也是如此。因此，酶的穩定性的提高是非常值得關注的。通常，有三種方法可以改善酶的穩定性：固定化，非共價修飾，化學修飾。在這三種方法中，由于普遍適用性，分離方便性，固定化是最重要和最實用的方法。迄今為止，如石墨烯、水凝膠、有機微粒、介孔二氧化硅、金屬有機骨架(MOFs)等具有大比面積和空隙體積的各種納米材料是酶固定化的理想材料(Nature Catalysis,2018,1(9):689-695)。

本發明中利用沸石咪唑酯骨架-8的多孔結構，實現了對鉛DNAzyme的固定(DNAzyme@ZIF-8)。沸石咪唑酯骨架結構(ZIFs)材料作為MOFs材料的一類，是由過渡金屬原子與咪唑或咪唑衍生物連接而生成的一類新型的、具有沸石拓撲結構的多孔材料，為固定化天然酶提供了有效的結合位點。ZIFs不僅具有MOFs的優點，而且同MOFs材料相比，具有更優良的熱穩定性和水溶液穩定性。通過ZIF-8固定DNAzyme提升了DNAzyme的環境穩定性，建立了一種通用型的熒光分析方法用于鉛離子的檢測。

發明內容